Imaging in vivo a due fotoni della retina del topo

Abstract

Fonte: Wang, Z., et al. Imaging transpupillare in vivo a due fotoni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra una tecnica per l'imaging retinico in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni. I topi anestetizzati vengono preparati per l'imaging fissando le loro teste, applicando lubrificante per gli occhi e posizionando un vetrino coprioggetti sull'occhio. Le cellule gangliari retiniche (RGC) che esprimono proteine fluorescenti vengono prima visualizzate utilizzando l'epifluorescenza per l'allineamento. Infine, viene impiegata l'imaging a due fotoni, che consente una visualizzazione ad alta risoluzione delle RGC.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del mouse per l'acquisizione dell'immagine

1. Anestetizzazione del topo per l'imaging
   NOTA: Per mitigare l'esposizione all'isoflurano, garantire un corretto evacuazione dei gas di scarico. Assicurarsi che la porta di scarico della camera di induzione dell'anestesia sia collegata a un contenitore del filtro del gas di lavaggio passivo e che l'uscita del portaobiettivi per anestesia del topo sia collegata a un contenitore del filtro del gas di lavaggio attivo con un vuoto fornito da un apparecchio di evacuazione del gas. Seguire le linee guida del produttore per il monitoraggio del peso del contenitore del filtro per la sostituzione.
   1. Anestetizzare il topo usando il cocktail di ketamina/xilazina. In alternativa, indurre l'anestesia tramite inalazione di isoflurano se si utilizza anche isoflurano per il mantenimento dell'anestesia (sessione di imaging > 30 minuti). Impostare il dispositivo per anestesia per piccoli animali in modo che riempia la camera di induzione con isoflurano al 5% miscelato con aria ambiente a una portata di 0,5 L/min. Posizionare il mouse nella camera di induzione e attendere 15 secondi affinché il topo venga anestetizzato.
   2. Portare il vaporizzatore di isoflurano allo 0% e dirigere il flusso dell'anestesia verso il nasello. Eseguire un "O₂" di 5 secondi della camera di induzione. Estrarre il mouse dalla camera di induzione e fissarlo nel supporto della testa, fissando il portaobiettivi.
   3. Utilizzare una miscela di isoflurano all'1% con aria ambiente a una portata di 0,5 L/min per il mantenimento dell'anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria a intervalli di 5 minuti durante l'anestesia, regolando la percentuale di isoflurano per mantenere una frequenza respiratoria di ~60 respiri/min.
      NOTA: Queste impostazioni (% isoflurano, portata) possono essere utilizzate anche per il mantenimento dell'anestesia indotta dal cocktail ketamina/xilazina.
2. Dilatazione della pupilla
   1. Preparare una soluzione di 1% p/v atropina e 2,5% p/v fenilefrina cloridrato in acqua. Conservare la soluzione dilatatrice a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
   2. Utilizzando un contagocce monouso, applicare una goccia della soluzione dilatatrice su ciascun occhio che verrà sottoposto a ripresa. Spegni le luci della stanza e attendi 5 minuti che la pupilla si dilata. Quando la pupilla è dilatata, tamponare la soluzione dilatatrice con un panno privo di lanugine.
      NOTA: Assicurarsi che la soluzione dilatatrice non entri nelle narici.
   3. Applicare una grande goccia di gel oculare lubrificante su ciascun occhio che verrà riprodotto. Se entrambi gli occhi devono essere ripresi, applicare un piccolo pezzo di pellicola trasparente sopra il gel oculare sull'occhio non imaging per prevenire la disidratazione. Se si esegue l'imaging di un solo occhio, applicare un unguento lubrificante per gli occhi sull'occhio che non verrà visualizzato.
3. Posizionamento del mouse per l'imaging
   1. Per fissare il mouse nel supporto della testa di imaging, ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la barra dell'auricolare non viene inclinata di un angolo di 60° o più rispetto all'orizzontale. Fissare il perno del condotto uditivo inferiore in posizione estesa verso l'interno e il perno del condotto uditivo superiore in posizione ritirata.
   2. Con il mouse rivolto verso la barra del morso, montare un orecchio sul perno inferiore esteso, inserendo il perno nel condotto uditivo. Allentare la vite che fissa il perno del condotto uditivo superiore ed estendere il perno nell'altro condotto uditivo. Serrare la vite per fissare la testa.
   3. Far scorrere la barra del morso verso la testa del mouse. Sollevare delicatamente la testa del topo, quindi abbassare gli incisivi mascellari del topo nel foro della barra del morso. Ritrarre la barra del morso con una leggera forza per fissare la testa del mouse e fissare la posizione della barra del morso serrando la vite.
   4. Se si utilizza l'isoflurano, far scorrere il nasello attraverso la sua fessura sulla barra del morso prima di fissare gli incisivi del topo. Fissare e serrare la posizione della barra del morso come al punto 1.3.3. Stringere il nasello utilizzando le due viti sulla parte superiore fino a quando non aderisce perfettamente al naso del mouse, ma non restringe il muso.
   5. Trasferire il mouse, nel supporto per la testa, sul tavolino del microscopio sotto l'obiettivo. Ruotare il braccio principale del supporto per la testa fino a quando la pupilla dell'occhio è orientata verso l'alto, in linea con il percorso della luce (Figura 1).
   6. Posizionare un vetrino coprioggetti #1.5 nel portafiltro compatto e fissare il supporto al tavolino del microscopio. Abbassare il vetrino coprioggetti verso l'occhio, a contatto con il gel lubrificante per gli occhi, in modo che si trovi orizzontalmente immediatamente sopra la cornea (Figura 1). Assicurarsi che il vetrino coprioggetti non tocchi la cornea.
      NOTA: Sul microscopio, assicurarsi che il percorso della luce di eccitazione sia impostato sull'epifluorescenza e che il percorso della luce di emissione sia impostato sull'oculare. Accendere l'illuminatore a epifluorescenza alla potenza più bassa e aprire l'otturatore dell'illuminatore. Scegliere la lunghezza d'onda dell'illuminatore a epifluorescenza e il filtro a fluorescenza corrispondenti al fluoroforo da visualizzare.
   7. Manovrare il tavolino nelle dimensioni X-Y e l'obiettivo in posizione Z utilizzando il controllo del tavolino e l'azionamento motorizzato della messa a fuoco fino a quando la luce di eccitazione a campo largo copre completamente la cornea. Guardando attraverso l'oculare, continuare a regolare la posizione Z del tavolino fino a quando le cellule fluorescenti o le strutture della retina non vengono messe a fuoco. Aumentare la potenza dell'illuminatore a epifluorescenza se il segnale del campione non è sufficientemente luminoso per risolvere singole cellule o strutture di interesse attraverso l'oculare.
      NOTA: Se hai problemi a localizzare la retina, l'iride è un punto di riferimento ad alto contrasto su cui ancorarsi e quindi mettere a fuoco verso la retina. Questo passaggio consentirà anche di verificare che la pupilla sia dilatata al massimo.
   8. Ottenere un'area di imaging sull'asse con la lente del mouse. Regolare l'angolazione del mouse utilizzando i vari gradi di libertà sul supporto della testa fino a quando non si verifica solo l'espansione o la contrazione della luce sfocata durante la regolazione del piano focale. Spegnere l'illuminatore a epifluorescenza e chiudere l'otturatore dell'illuminatore.
      NOTA: Una significativa parallasse X-Y di luce sfocata durante lo scorrimento dei piani focali della direzione Z indica che la retina non è sull'asse rispetto al percorso della luce dell'immagine.

2. Acquisizione di immagini a due fotoni

1. {Parametri di configurazione e acquisizione dell'immagine
   NOTA: Spegni le luci della stanza e copri le fonti di luce diffusa nella stanza. Assicurarsi che l'illuminatore a epifluorescenza sia spento e che l'otturatore dell'illuminatore sia chiuso.
   1. Commutare il percorso della luce di eccitazione verso il laser e il percorso della luce di emissione verso i tubi fotomoltiplicatori (PMT).
   2. Nel software di acquisizione delle immagini, impostare una dimensione del fotogramma di 512 x 512 e una media dei fotogrammi di 3. Impostare gli incrementi per fetta su -8 μm. Designare z-stepping per iniziare dalla parte superiore della pila e progredire verso il basso, riducendo al minimo l'attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori.
      NOTA: La dimensione del passo può essere ridotta per aumentare la risoluzione Z al costo di un aumento del tempo di imaging, ma passi di 8 μm sono sufficienti per risolvere i somata cellulari in questa configurazione di imaging.
   3. Accendere e abilitare i PMT. Regolare la tensione PMT a 680 V. Abilitare l'otturatore di eccitazione.
      NOTA: I PMT alimentati sono suscettibili di danni leggeri. Assicurarsi che l'illuminatore a epifluorescenza sia spento, che la tenda dell'involucro del microscopio sia tirata e che le luci della stanza siano spente.
   4. Iniziare un'anteprima dell'immagine dal vivo del tessuto bersaglio, iniziando con l'1% di potenza laser. Regola automaticamente la luminosità del display per visualizzare le celle o le strutture di interesse. Regolazione automatica della fase di scansione. Se il tessuto target è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare il limite impostato al punto 2.4.4, che corrisponde a 45 mW.
      NOTA: Per un'immagine a 16 bit, un valore di visualizzazione di ~1000 quando la regolazione automatica della luminosità in un piano Z contenente strutture di interesse indica una luminosità sufficiente del campione.
   5. Manovrare il tavolino del microscopio in direzione X-Y per centrare l'area di imaging desiderata, quindi navigare verso il piano Z con le strutture di interesse a fuoco.
      NOTA: L'imaging adiacente alla testa del nervo ottico gli permette di fungere da punto di riferimento inequivocabile per gli esperimenti di imaging cronico.
   6. Se si tratta di un esperimento time-lapse cronico, aprire un'immagine precedente sul computer di acquisizione e utilizzarla come riferimento per trovare la stessa area di interesse. Assicurarsi che l'angolo di imaging sia simile a quello delle immagini precedenti per acquisire lo stesso set di cellule con una parallasse minima.
      NOTA: Per visualizzare le stesse celle dei punti temporali precedenti (Figura 2), è probabile che sia necessaria un'ulteriore regolazione della posizione della testa del mouse.
   7. Impostare i limiti Z dello stack di immagini passando ai piani Z di interesse più in alto e in basso e acquisire l'immagine. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, disabilitare i PMT e l'otturatore di emissione. Riportare il percorso della luce di emissione all'oculare e il percorso della luce di eccitazione all'illuminazione a epifluorescenza. Rimuovere il mouse dal tavolino del microscopio.

Risultati

Figura 1: Posizionamento dei topi per l'imaging in vivo. Per posizionare il mouse con la pupilla sull'asse con il percorso della luce, il mouse anestetizzato viene prima trattenuto in un supporto per la testa, la testa viene ruotata e angolata, una grande goccia di gel lubrificante per gli occhi viene posizionata sull'occhio e il mouse viene posizio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#1.5 vetrino coprioggetti	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL siringa in vetro	Hamilton	80950	22G ago cementato
Pompa d'aria per anestesia	RWD Life Science	R510-30
Atropine	Sigma	A0132	Per la soluzione
Dispositivo di base per anestesia per piccoli animali	RWD Life Science	R500IE
Capillare in vetro borosilicato	Sutter	B150-86-10	Diametro esterno 1.50 mm, diametro interno 0.86 mm, lunghezza 10 cm
CFP/YFP filter cube	Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Unità di rilevamento PMT a due canali	Scientifica	S-MPLG-1002
Pompa di circolazione	Braintree Scientific	tp-700	Set to 37 °C
Clingfilm	VWR	10713-916
Portafiltro compatto	ThorLabs	DH1	Tiene il vetrino coprioggetti sull'occhio
Cx3cr1-GFP topi transgenici (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
Telaio del controller DAQ	National Instruments	PXIe-1073
Dispositivo di acquisizione dati	National Instruments	BNC-2090A
Modulo FPGA con digitalizzatore	National Instruments	NI-5734
Apparecchio per l'evacuazione dei gas	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe lubrificante gel per gli occhi	Alcon	(dalla farmacia locale)	Per l'uso durante l'imaging
GFP/Red filter cube	Chroma	custom	535/30, 560 long pass, 605/70
Heating pad	McKesson Medical and Surgical	190147
HyperScope Launch Optics per l'uso con Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080
HyperScope Main module	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo Module	Scientifica	MP-100443
ImageJ Fiji software		Freeware
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Bombola per filtro gas isoflurano (scavenging attivo)	RWD Life Science	R510-31
Bombola per filtro gas isoflurano (scavenging passivo)	RWD Life Science	R510-31S
ketamina HCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI software	Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b
meloxicam (5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgesic
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
estrattore per micropipette	Sutter	Flaming/Brown Model P-97
Olio minerale	Fisher	BP2629-1
Morsetto emostatico Mini bulldog	Fine Science Tools	18053-28
Tubo EVA in miniatura 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Tubo EVA in miniatura 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
Supporto per testa di mouse	Narishige	SGM-4
No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Optic Posts 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Kit misuratore di potenza ottica	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Fenilefrina cloridrato	Sigma	P6126	Per soluzione
Pockels cell	Conoptics	350-80-02
Amplificatore di pockels cell	Conoptics	Model 302RM
Proparacaina cloridrato	Sigma	1571001	Per l'immobilizzazione degli
Red & Far Red filtro a passaggio corto Cube	Chroma	custom	560 short pass
Rotating 1/2" post clamp	ThorLabs	SWC
ScanImage package	Vidrio Technologies	Freeware	Software di acquisizione immagini; Versione 5.4.0 (2018); richiede MATLAB
Soluzione di cloruro di sodio, sterile (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomicroscopio	Leica	S9 E
Centrifuga da tavolo	Oxford	Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polimixina B antibiotico unguento oftalmico	Zoetisus	NA	Per l'uso dopo l'iniezione
Sistema di raffreddamento ThermoRack	Sistemi di raffreddamento a stato solido	ThermoRack 401	Set to to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre topi transgenici (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16962
VGlut2-Cre topi transgenici (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
White petrolato-mineral oil lubrificante unguento per gli occhi	Stye	NA	For utilizzare dopo l'imaging
xilazina HCl (20 mg/mL)	Akorn	NDC 59399-110-20

del dilatatore della pupilla del mouse dilatatrice pupillare occhi intravitreale