Imaging a fluorescenza delle dinamiche neuroimmunitarie utilizzando un impianto cranico

Abstract

Fonte: Bisht, K., et al. Mappatura precisa del cervello per eseguire l'imaging ripetitivo in vivo delle dinamiche neuro-immunitarie nei topi. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra l'imaging a fluorescenza delle dinamiche neuroimmunitarie in un topo transgenico con un impianto cranico. La stabilità vascolare e neuronale viene rilevata insieme ai cambiamenti dinamici della microglia, riflettendo le risposte immunitarie all'attività neuronale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparazione del topo per l'impianto della

finestra cranicaNOTA: Varie linee di topi transgenici con tag fluorescenti sono adatte per l'imaging.

1. Usa CX3CR1GFP/+ topi per visualizzare la microglia in vivo. In genere, vengono utilizzati topi giovani e giovani adulti di età compresa tra 4 e 10 settimane che pesano 17-25 g.
   NOTA: Sebbene questo approccio sia adatto anche per i topi pre-svezzati, la necessità di riportare i topi nelle loro gabbie con le loro madri per l'alimentazione può complicare il recupero se la madre non si prende cura adeguatamente dei cuccioli dopo l'intervento chirurgico. Pertanto, si raccomanda l'uso di topi dopo lo svezzamento.
2. Anesteticizza il topo usando isoflurano (5% di flusso di ossigeno per induzione per 1 minuto) in una camera anestetica. Verificare che il mouse non mostri alcuna risposta di movimento o contrazione ai pizzicamenti delle dita dei piedi e/o della coda. Porta il topo fuori dalla camera e, all'aria aperta, radere accuratamente i peli sulla testa tra le orecchie da circa il livello degli occhi fino alla parte superiore della regione del collo usando un tagliacapelli.
   NOTA: La concentrazione di isoflurano utilizzata dipende dalle dimensioni della camera di induzione. Pertanto, per le camere più piccole, l'isoflurano al 3-4% può essere utilizzato per indurre efficacemente l'anestesia, mentre le camere più grandi richiederanno fino al 5%.
3. Sposta il mouse sul cono della stazione di chirurgia stereotassica per l'anestesia (1,5-2% per il mantenimento durante l'intervento), stabilizza la sua testa usando le barre auricolari e tieni il mouse su un termoforo per mantenere calda la sua temperatura corporea.
4. Lubrifica entrambi gli occhi con unguento per gli occhi. Iniettare 100 μL di bupivacaina allo 0,25% (per fornire un'analgesia locale al topo che durerà 8-12 ore) e 100 μL di 4 mg/mL di desametasone (per ridurre l'infiammazione che può derivare dalla procedura chirurgica) per via sottocutanea nel sito di incisione. Lasciare riposare il mouse per almeno 5 minuti prima di passare al passaggio successivo.
5. Pulisci la testa rasata con tre tamponi alternati di betadine e alcol al 70%. Usando una lama chirurgica o delle forbici, praticare un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana che si estende dalla parte posteriore della regione del cranio tra le orecchie all'area frontale tra gli occhi. La pelle rimanente viene tagliata per esporre il cranio.
6. Pulisci il tessuto connettivo situato tra il cuoio capelluto e il cranio sottostante con perossido di idrogeno al 3% (H₂O₂) e localizza l'area del cervello da fotografare con coordinate stereotassiche.
   NOTA: C'è spesso del sanguinamento (passaggio 1.5) dall'incisione sulla superficie del cranio. Questo sanguinamento di solito si risolve da solo entro 3-5 minuti. La pulizia con il perossido aiuta. Si nota anche che un precedente trattamento con bupivacaina (fase 1.4) limita la quantità di sanguinamento durante questo periodo.

2. Chirurgia di impianto della finestra cranica del topo

1. Pratica un'apertura circolare di ~4 mm nel cranio usando una punta dentale (diametro della punta di 0,7 mm) e rimuovi con cura questa parte del cranio usando una pinza appuntita. Per l'imaging della corteccia somatosensoriale di topi di 6-8 settimane, individuare il centro della craniotomia a -2,5 posteriore e ± 2,0 laterale al bregma. Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con soluzione fisiologica sterile e tamponi di cotone per raffreddare il cervello, pulire i detriti ossei e ammorbidire l'osso del cranio per l'eventuale rimozione.
   NOTA: Le coordinate per la craniotomia variano a seconda della regione di interesse e dell'età dei topi.
2. Dopo aver rimosso il cranio, posiziona con cura un piccolo coprioggetto (misura #0 a 0,1 ± 0,02 mm di spessore) inumidito con soluzione salina nella craniotomia. Asciugare la soluzione salina in eccesso con una salvietta sterile.
3. Utilizzando un applicatore appuntito (come la punta di una pipetta o l'estremità appuntita di un bastoncino di cotone rotto in legno), applica la colla cianoacrilica intorno alla finestra e lasciala attaccare al cervello e al cranio. Applicare la colla di base sul resto del cranio e polimerizzarla con una lampada polimerizzante per 20-40 s. Preparare un pozzetto intorno alla finestra con la colla finale e polimerizzare con una lampada polimerizzante di 20-40 s.
4. Incolla una piccola piastra di testa sul cranio sull'emisfero controlaterale della craniotomia prima con la colla di base come primer e poi con la colla finale. Polimerizzare entrambi con la lampada polimerizzante per 20-40 s ciascuno.
   NOTA: Le suture non sono necessarie se il cranio è coperto di colla durante questa procedura.

3. Cura post-operatoria

1. Consenti al topo di svegliarsi senza anestesia (il recupero fatto su un termoforo riduce il tempo di recupero) e rimettilo nella sua gabbia di casa una volta completamente sveglio. Iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR (0,5 mg/kg) come analgesia post-operatoria sufficiente per 72 ore.
2. Per facilitare un sano recupero dall'intervento chirurgico, fornisci al topo cibo extra morbido, come cibo solido normale imbevuto di acqua per ammorbidirlo o cibo sotto forma di gel.
   NOTA: È sufficiente una fornitura una tantum di cibo morbido subito dopo l'intervento.
3. Monitora quotidianamente il mouse per verificarne la salute e il corretto recupero per le prime 72 ore della procedura chirurgica. Successivamente, l'imaging dall'intervento di impianto della finestra verrà eseguito già dopo 2 settimane.
   NOTA: Se fatto bene, i topi si riprendono bene mostrando comportamenti ambulatoriali normali, sufficiente esplorazione della gabbia, buona idratazione, aumento di peso stabile e ampie interazioni con altri topi nella gabbia e altri oggetti nella gabbia. I topi che mostrano letargia, disidratazione e perdita di peso superiore al 10% dopo l'intervento chirurgico vengono soppressi e rimossi dallo studio.

4. Mappatura cerebrale a due fotoni per l'imaging iniziale

1. Anestetizzare il topo (isoflurano, 5% di induzione e 1,5% di mantenimento). Stabilizzare la testa utilizzando le viti per montare la piastra di testa sul tavolino del microscopio a due fotoni, mantenutala su una piastra riscaldante a 35 °C. Iniettare per via intraperitoneale 100 μL di colorante per vasi sanguigni come la rodamina B (2 mg/mL).
   NOTA: L'imaging potrebbe essere fatto anche in topi svegli senza anestesia. Tuttavia, studi recenti indicano che l'anestesia influisce sulle dinamiche di sorveglianza microgliale. La fissazione della testa per l'imaging a due fotoni nei topi svegli aumenta lo stress anche durante l'imaging cronico per almeno 25 giorni.
2. Pulisci delicatamente la superficie della finestra cranica usando un batuffolo di cotone tamponato con etanolo al 70%. Metti alcune gocce d'acqua o soluzione salina sulla finestra cranica e abbassa la lente dell'obiettivo nella soluzione poiché l'obiettivo è una lente ad immersione.
3. Disegna a mano una mappa grossolana per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni in un quaderno di laboratorio mentre guardi attraverso l'oculare per epifluorescenza. Utilizzare questo disegno per identificare le regioni specifiche durante l'imaging a due fotoni. In alternativa, scatta foto dei vasi sanguigni attraverso una fotocamera montata sul microscopio o tramite una fotocamera portatile o un telefono.
   NOTA: Queste immagini e immagini disegnate a mano servono a facilitare la rivisitazione delle stesse ampie regioni al microscopio prima dell'imaging a due fotoni. Non si tratta di una mappatura precisa delle immagini.
4. Sotto l'imaging di due fotoni, raccogli immagini di cellule e vasi fluorescenti secondo necessità. Prendi appunti accurati con le coordinate appropriate per assicurarti che le regioni precise possano essere rivisitate per l'imaging successivo. Raccogli diversi campi visivi in questa sessione di imaging iniziale, ad esempio acquisisci immagini z-stack ogni 1-2 μm attraverso un volume di tessuto.
   NOTA: Durante la raccolta di immagini da due fotoni, i punti di riferimento dei vasi sanguigni vengono utilizzati per la mappatura grossolana. Se è necessaria una mappatura fine, vengono utilizzati dendriti marcati con YFP di topi Thy1-YFP.
   1. Usa questi parametri raccomandati per l'imaging: una lunghezza d'onda di 880-900 nm è ottimale; per GFP e/o eccitazione dsRed / Rodamina viene utilizzato uno specchio dicroico da 565 nm con filtri di emissione da 525/50 nm (canale verde) e 620/60 nm (canale rosso); per la separazione GFP e YFP viene utilizzato uno specchio dicroico da 509 nm con filtri di emissione da 500/15 e 537/26 nm; la potenza al cervello viene mantenuta a 25 mW o inferiore; la risoluzione dell'immagine è 1024 x 1024 pixel, il campo visivo acquisito con un obiettivo 25X 0,9 NA con un fattore di zoom 1,5X è 295,24 x 295,24 μm.
5. Alla fine dell'imaging, togli il mouse dal palco, lascialo svegliare dall'anestesia e torna nella sua gabbia di casa fino a una futura sessione di imaging.

5. Imaging e re-imaging a due fotoni

1. Per future sessioni di imaging successive, che potrebbero durare da poche ore a mesi dopo la sessione di imaging iniziale, anestetizzare il topo (isoflurano, induzione al 5% e mantenimento all'1,5%), montare sul microscopio a due fotoni, mantenere su una piastra riscaldante e reiniettare 100 μl di un colorante per vasi sanguigni come la rodamina B (2 mg/mL).
2. Apri le immagini precedentemente ottenute in ImageJ e, utilizzando queste immagini così come le note della sessione precedente, identifica le aree precedentemente riprodotte e ri-immaginale attentamente.
3. Ripeti l'operazione finché la finestra di imaging è libera o essenziale per l'estensione dello studio.

Materiali

Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Colla cianoacrilica (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Punta da trapano	Strumenti di Fine Science	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Colla per primer)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1