Imaging a fluorescenza della dinamica del calcio nelle giunzioni neuromuscolari nel diaframma di un topo transgenico

Abstract

Fonte: Heredia, D. J., et. Al. Imaging ex vivo della segnalazione del calcio cellulo-specifica alla sinapsi tripartita del diaframma del topo. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'imaging a fluorescenza della dinamica del calcio alle giunzioni neuromuscolari (NMJ) in un topo transgenico che esprime indicatori di calcio geneticamente codificati. Un NJM è identificato da recettori dell'acetilcolina marcati in fluorescenza nel diaframma con il nervo frenico. Uno splitter di immagini viene utilizzato per visualizzare più segnali contemporaneamente. Viene erogato uno stimolo elettrico e viene registrata la variazione della fluorescenza all'NMJ in risposta all'afflusso di calcio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione dei diaframmi e dei nervi frenici da topi transgenici

1. Acquista topi transgenici e primer oligonucleotidici per genotipizzare questi topi.
   1. Allevare un topo di età compresa tra 3 e 6 mesi che esprime una copia dell'allele Cre-driver transgenico/knock-in appropriato e zero copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale con un secondo topo della stessa età che esprime una o due copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale e zero copie dell'allele Cre-driver.
   2. Genotipizzare i cuccioli e marcare quelli con gli alleli Cre e GCaMP3/6 condizionali: d'ora in poi saranno chiamati topi a doppia transgenica (ad esempio, Myf5-Cre, GCaMP3 condizionale).
      Nota: In questo modo, tutti i dati deriveranno da topi che esprimono una copia sia dell'alleli Cre che di quello condizionale GCaMP3/6. Ciò è particolarmente importante quando si aggiungono altri topi mutanti (ad esempio, knockout) a questi incroci.
2. Quando i topi doppiamente transgenici hanno l'età appropriata (ad esempio, il giorno 0 o 5 postnatale [P0 o P5] o l'età adulta), sopprimere i topi decapitandoli con le forbici (per i topi di età inferiore a P10) o mettendoli in una camera di inalazione di isoflurano. Quando non rispondono più a pizzicare la coda con un paio di pinze, sono pronti per il sacrificio.
3. Sacrifica l'animale per decapitazione con un paio di forbici.
4. Sezionare trasversalmente l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore e i polmoni con le forbici per iridectomia.
5. Sezionare il fegato, il cuore e i polmoni, facendo attenzione a mantenere una lunghezza del nervo frenico sufficientemente lunga da poter essere aspirata in un elettrodo di aspirazione (cioè 1 - 2 cm).
   Nota: Il nervo frenico sinistro può essere identificato come un pezzo di tessuto bianco che entra nella porzione mediale del diaframma sinistro. Non deve essere tagliato durante l'asportazione dei polmoni. Il nervo frenico destro corre all'interno di un pezzo di fascia che contiene anche la vena cava superiore ed è più sottile e più bianco della vena cava. Insieme, entrambi penetrano nel diaframma mediale destro.
6. Rimuovere ulteriormente la gabbia toracica e la colonna vertebrale, ad eccezione della sottile cresta attorno al diaframma.
7. Porre il diaframma e il campione di nervo frenico in una provetta per microfughe con soluzione di Krebs-Ringer con 1 μg/mL di 594-αBTX per 10 minuti al buio.
   Nota: Questa concentrazione di 594-αBTX marca i recettori dell'acetilcolina (AChR) senza bloccarne la funzione (osservazione personale).

2. Stimolazione e registrazione dei potenziali d'azione muscolari

1. Utilizzando spilli minutici, immobilizzare il diaframma fissandolo su un piatto di 6 cm rivestito con gel dielettrico siliconico e riempito con ~8 mL di soluzione ossigenata di Krebs-Ringer e posizionarlo sul tavolino del microscopio. Perfondere il diaframma con altra soluzione di Krebs-Ringer (8 mL/min) per 30 min.
   Nota: Questo risciacqua il 594-αBTX non legato, oltre a equilibrare il tessuto dopo la dissezione.
2. Realizzare un elettrodo di aspirazione secondo i metodi stabiliti.
   1. Con un ingrandimento di 4X, utilizzando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo di aspirazione sul nervo frenico sinistro e applicare l'aspirazione estraendo il fusto di una siringa da 5 ml collegata al tubo collegato all'elettrodo di aspirazione.
      Nota: Quando viene aspirato con successo nell'elettrodo di aspirazione, il nervo frenico è teso. Accendi lo stimolatore e stimola il nervo frenico premendo l'interruttore manuale 1x.
   2. Assicurarsi che il diaframma si contragga in risposta alla stimolazione a 1 Hz esaminandolo visivamente con l'illuminazione a campo chiaro. In caso contrario, regolare la tensione ruotando la manopola della tensione in modo incrementale per ottenere un impulso sovramassimale, che può essere verificato mediante un esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non è visibile, soffiare via il nervo con la siringa e tentare di aspirarlo nuovamente applicando l'aspirazione.
3. Spegnere la perfusione e aggiungere l'inibitore muscolo-specifico della miosina BHC6 o l'antagonista del canale del sodio voltaggio-dipendente μ-conotossina8 a una concentrazione finale di 100 μM.
   1. Per produrre 100 μM di BHC, pipettare 4 μL di 200 mM di stock in DMSO e prediluirlo in 1 mL di soluzione di Krebs-Ringer.
   2. Rimuovere 1 mL di soluzione di Krebs-Ringer dal piatto.
   3. Aggiungere il BHC prediluito al piatto.
      Nota: Questa prediluizione aiuta a prevenire l'induzione da parte del DMSO non diluito di una risposta fluorescente non transitoria nelle cellule che esprimono GCaMP3.
   4. Attendere 30 minuti e poi accendere la perfusione della soluzione fresca di Krebs-Ringer per altri 20 - 30 minuti.
4. Preparare l'elettrodo di registrazione.
   1. Indossando i guanti, posizionare un vetro filamentato borosilicato con un diametro esterno (OD) di 1 mm e un diametro interno (ID) di 0,4 mm in un estrattore per micropipette, serrare le manopole per bloccarlo in posizione e chiudere lo sportello dell'estrattore.
   2. Utilizzando un estrattore P-97, programmare le seguenti impostazioni: calore a 900, trazione a 120, velocità a 75, tempo a 250, pressione a 500 e nessun anello aggiuntivo.
      Nota: La resistenza (R) viene misurata utilizzando i controlli software dell'amplificatore: il software di acquisizione dati conferma la resistenza risolvendo la formula V = IR. Il controller del software fa passare una corrente nota (I) (tipicamente 1 nA) attraverso l'elettrodo e misura la variazione di tensione (V), permettendoci così di risolvere per R.
   3. Per i diaframmi embrionali, assicurarsi che la resistenza sia vicina a 60 MΩ e per i diaframmi più vecchi, 10 - 20 MΩ. Caricare l'elettrodo di registrazione con 3 M di cloruro di posazio (KCl).
5. Con un ingrandimento di 10X, abbassare l'elettrodo nel muscolo, utilizzando un secondo micromanipolatore sul lato opposto del tavolino come elettrodo stimolante.
6. Utilizzando il software di acquisizione dati elettrofisiologici, attendere che il potenziale di membrana a riposo cambi da 0 a -65 mV o inferiore.
7. Stimolare a 1 Hz e verificare la presenza di un potenziale d'azione muscolare controllando un grande potenziale che mostra un modesto overshoot (potenziale che sale al di sopra di 0 mV quando inizia a -65 mV o inferiore). Non confondere un artefatto di stimolazione con un potenziale d'azione.
   Nota: I potenziali hanno una durata significativamente più lunga (~5 ms) rispetto agli artefatti di stimolazione.

3. Imaging della fluorescenza del campione

1. A un ingrandimento di 20X, individuare la banda della placca terminale al centro del muscolo cercando giunzioni neuromuscolari marcate con 594-αBTX o NMJ sotto eccitazione di luce verde/gialla (550 nm). Passa all'eccitazione della luce blu (470 nm) per visualizzare le risposte Ca²⁺ nei muscoli, nei motoneuroni o nelle cellule di Schwann.
2. Se lo si desidera, è possibile impostare lo splitter di immagini con filtri passa-banda e un filtro dicroico a bordo singolo per l'imaging a doppia lunghezza d'onda.
3. Per calcolare la fluorescenza massima (Fmax) esibita dal tessuto che esprime GCaMP3/6, aggiungere 12 μL di cloruro di potassio 3 M (KCl) alle preparazioni del diaframma.
   1. Esegui esperimenti con la barra della luminosità sulla barra della tabella di ricerca impostata al 110% del livello al quale il tessuto che esprime GCaMP3/6 mostra saturazione a un ingrandimento 20X senza binning in risposta a KCl.
4. Registra a 20 fotogrammi al secondo in modo da non perdere alcun evento veloce.
5. Stimolare con 1 - 45 s di 20 - 40 Hz di stimolazione nervosa erogando un treno di impulsi utilizzando l'elettrodo di aspirazione o aggiungere agonisti farmacologici mediante applicazione di bagno o perfusione e raccogliere risposte fluorescenti dinamiche Ca²⁺ in un sottotipo di cellula insieme al segnale statico 594-αBTX NMJ.
   Nota: Se i topi con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) rossi o rossi lontani diventano disponibili per l'uso presso l'NMJ, possono essere utilizzati per raccogliere due segnali dinamici che riflettono due elementi cellulari distinti presso l'NMJ.
6. Quando gli esperimenti di imaging o elettrofisiologici sono terminati perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, perfondere l'acqua attraverso le linee di perfusione e aspirare l'acqua 2 volte - 3 volte attraverso l'elettrodo di aspirazione per assicurarsi che i sali non si accumulino.

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