Imaging a diffusione Raman stimolato a due colori del tessuto cerebrale del topo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Rilevamento del segnale SRS

1. Modulazione elettroottica (EOM)
   NOTA: EOM di 20 MHz viene utilizzata per modulare l'ampiezza di Stokes. Come discusso in seguito, l'EOM è derivato dal treno di impulsi laser a 80 MHz, necessario per la modulazione ortogonale. È possibile utilizzare altre frequenze di modulazione se viene eseguita solo la SRS monocolore o iperspettrale. In tal caso, la sincronizzazione della frequenza di modulazione con la frequenza del laser non è necessaria. Per pilotare l'EOM è possibile utilizzare un generatore di frequenza con un amplificatore di potenza a radiofrequenza (RF). Di conseguenza, i passaggi 1.1.1-1.1.4 possono essere saltati.
   1. Posizionare un campionatore di fascio nel percorso del fascio di Stokes per raccogliere il 10% del fascio e inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi a 80 MHz.
      NOTA: Il segnale del fotodiodo viene inviato a un divisore di frequenza per generare un'uscita TTL a 20 MHz. Questo output viene ulteriormente inviato in un buffer di fanout per replicare l'output in quattro output identici a 20 MHz. Una delle uscite viene utilizzata per attivare l'oscilloscopio.
   2. Prendi una delle uscite del buffer di fanout e filtrala con un filtro passa-banda per ottenere un'onda sinusoidale di 20 MHz. Utilizzare un attenuatore RF per regolare la tensione picco-picco in uscita a ~500 mV.
   3. Invia l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione. Invia questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collega l'uscita dell'amplificatore a EOM.
   4. Sblocca il raggio di Stokes e ottimizza la profondità di modulazione di EOM1 posizionando un fotodiodo nel percorso del raggio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione (rapporto valle/picco) non appare soddisfacente.
      NOTA: Alla modulazione di 20 MHz (1/4 della frequenza di ripetizione del laser), sono previsti due impulsi ogni 50 ns.
2. Sovrapposizione temporale
   NOTA: La sovrapposizione temporale della pompa e di Stokes si ottiene ritardando uno dei due treni di impulsi laser con un retroriflettore montato su uno stadio di ritardo (La Figura 1 mostra il ritardo di Stokes). La sovrapposizione grossolana viene monitorata con l'oscilloscopio e la sovrapposizione fine viene monitorata dal segnale SRS. Una sottile sovrapposizione temporale può essere ottenuta anche con un autocorrelatore, se disponibile.
   1. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser. Blocca prima la trave di Stokes. Ingrandisci uno dei picchi di pulsazione della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio.
   2. Blocca la trave della pompa e sblocca la trave di Stokes. Traslare la fase di ritardo in modo che corrisponda temporalmente la posizione di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente. Vedi Figura 2 per una visualizzazione della sovrapposizione temporale di due travi.
      1. (FACOLTATIVO) Se la traslazione dello stadio di ritardo è insufficiente per far corrispondere temporalmente i due raggi, spostare lo stadio di ritardo al centro del suo intervallo di movimento.
      2. Calcola la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due raggi prendendo la differenza temporale tra i due raggi e moltiplicando la differenza per la velocità della luce per trovare la quantità di distanza necessaria per abbinare temporalmente i due raggi.
      3. Allungare il percorso del raggio del raggio più veloce o accorciare il percorso del raggio più lento in modo che corrisponda approssimativamente al ritardo temporale di conseguenza.
   3. Preparare un campione di vetrino da microscopio con dimetilsolfossido (DMSO) e nastro biadesivo come distanziatore per trattenere il campione tra il vetrino e un vetrino coprioggetti.
   4. Posizionare il campione sul microscopio con il lato del vetrino coprioggetti rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Passare il microscopio all'illuminazione in campo chiaro e osservare il campione dall'oculare. Trova il fuoco del campione trovando prima il fuoco sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria all'interfaccia del nastro di vetro, quindi sposta il fuoco in modo che si trovi tra i due strati di nastro.
      NOTA: Assicurarsi che i raggi laser siano bloccati prima di guardare nell'oculare.
   5. Impostare l'uscita del raggio sintonizzabile su 798 nm. In base alla portata ottica del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia ~40 mW ciascuno per la pompa e i raggi di Stokes al fuoco dell'obiettivo.
   6. Apri ScanImage in MATLAB (o altro software di scansione che controlla il microscopio) e fai clic sul pulsante etichettato FOCUS per avviare la scansione.
      NOTA: I raggi laser saranno scansionati raster-attraverso il campione per generare un'immagine. Il segnale a bassa frequenza emesso dal fotodiodo (<100 kHz) viene inviato direttamente al canale 1 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CC). L'uscita ad alta frequenza (>100 kHz) dal fotodiodo viene inviata all'amplificatore lock-in e l'uscita X del segnale dell'amplificatore lock-in viene inviata al canale 2 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CA).
   7. Regolare lo specchietto di sterzo prima dello scanner galvo per centrare il segnale CC sul display del canale 1. Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare attentamente l'uscita di blocco mostrata sul display del canale 2 (cioè il canale CA).
      NOTA: Quando la pompa e Stokes coincidono nel tempo, verrà visualizzato un segnale sul canale CA. È utile regolare la scala dei colori del canale CA per visualizzare la piccola variazione di intensità.
   8. Massimizza l'intensità del segnale CA regolando con precisione il ritardo. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA (mantenendo il canale CC centrato). Regolare la fase dell'amplificatore di blocco per massimizzare il segnale. Vedere Figura 3 per un segnale soddisfacente.

3. Ottimizzazione della risoluzione spettrale

NOTA: I fasci di pompa e Stokes che raggiungono il campione dovrebbero avere la stessa quantità di dispersione del ritardo di gruppo (GDD) per massimizzare la risoluzione spettrale. La dispersione dipende fortemente dalla configurazione sperimentale. La configurazione sperimentale qui descritta utilizza impulsi a femtosecondi a 1.040 nm e 800 nm rispettivamente come Stokes e pompa. Le dense bacchette di vetro flint (H-ZF52A) sono utilizzate come mezzo di allungamento degli impulsi.

1. Inserire 48 cm di un'asta di vetro altamente dispersiva (H-ZF52A o vetro flint denso equivalente) nel percorso del fascio di 800 nm. Stimare il GDD utilizzando Eq (1):

   

   NOTA: GVD di vari materiali vetrosi a diverse lunghezze d'onda può essere trovato dalla risorsa del database dell'indice di rifrazione. Ad esempio, H-ZF52A ha un GVD di 220,40 fs²/mm a 800 nm. Il GDD totale è 105792 fs².

2. Calcola quanti cm dell'asta di vetro dispersiva è necessaria per aggiungere al percorso del fascio di 1.040 nm in modo che corrisponda al GDD della pompa. Inserire la lunghezza appropriata delle barre di vetro dispersive nel percorso del fascio di 1.040 nm in modo che corrisponda approssimativamente al GDD del raggio di 800 nm. Si noti che l'aggiunta di aste di vetro modificherà la sovrapposizione temporale dei due raggi e potrebbe essere necessaria una regolazione del ritardo.
3. Calibrazione della risoluzione spettrale
   1. Crea un campione di vetrino per microscopio con DMSO. Posizionare il vetrino sul microscopio e controllare la potenza dei raggi che escono dal condensatore del microscopio. Regolare la potenza di conseguenza per avere ~40 mW ciascuno al fuoco del campione.
   2. Apri ScanImage da MATLAB. Trova il segnale SRS massimo scansionando lo stadio di ritardo, che corrisponde al picco Raman di 2.913 cm^-1 di DMSO. Stimare la posizione del tavolino in base alla posizione del tavolino precedente con l'aumento della lunghezza del percorso ottico dovuto all'inserimento delle aste. Riallineare la sovrapposizione spaziale della trave a causa della piccola deviazione della trave quando vengono aggiunte barre di vetro.
   3. Salva una scansione SRS iperspettrale scattando in sequenza una serie di immagini SRS mentre muovi il tavolino motorizzato.
      NOTA: L'intervallo di scansione del ritardo copre due picchi Raman, corrispondenti ai picchi Raman di 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1 di DMSO, rispettivamente. Queste due transizioni si osservano quando si utilizza una pompa da 800 nm e un laser Stokes da 1.040 nm.
   4. Traccia gli spettri SRS della soluzione DMSO utilizzando ImageJ o MATLAB. Adatta il grande picco DMSO da 2.913 cm^-1 a una funzione gaussiana o lorentziana in MATLAB per calcolare la larghezza completa a metà massimo (FWHM) del picco.
      NOTA: I risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4. Se è presente un solo picco ampio, significa che la risoluzione spettrale è troppo scarsa per distinguere i due picchi e sono necessarie più barre di vetro, oppure che l'intervallo scansionato era troppo piccolo per rilevare il secondo picco. Tipicamente, una risoluzione spettrale accettabile DMSO è ~20-25 cm^-1 quando si utilizza una lunghezza di >60 cm. Una risoluzione più bassa viene spesso utilizzata per l'imaging dei tessuti per scambiare segnali più alti con impulsi più brevi.
4. (FACOLTATIVO) Utilizzare un autocorrelatore o un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) per determinare la durata dell'impulso di ciascun braccio per calcolare esattamente la quantità di GDD e la lunghezza delle aste necessarie per abbinare il GDD tra la pompa e lo Stokes.
5. Ripetere i passaggi 3.3.2-3.3.4 per diverse lunghezze dell'asta sul fascio Stokes per trovare la risoluzione spettrale ottimale, il che significa che la migliore corrispondenza GDD è stata trovata sperimentalmente. Utilizzare più set di barre di vetro di lunghezza diversa per ottenere una risoluzione spettrale ottimale.

4. Caratterizzazione segnale-rumore (SNR)

1. Assicurarsi che il passaggio 4.2 venga eseguito dopo il completo allineamento spaziale e temporale.
2. Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2.913 cm^-1 di 2.913 cm. Aprire l'immagine in ImageJ e selezionare una piccola area al centro dell'inquadratura. Usa la funzione misura per calcolare la media e la deviazione standard dei valori nell'area selezionata.

3. Dividi il valore medio dell'area selezionata per la deviazione standard per trovare il valore SNR, come in Eq (2).

   

   NOTA: Un buon SNR per il sistema (con una costante di tempo di lock-in di 4 μs) utilizzando DMSO a 40 mw/40 mw a fuoco per entrambi i bracci è >800. Concentrazioni più basse di DMSO o una potenza inferiore possono essere utilizzate per una stima più accurata dell'SNR se la scheda di acquisizione dati ha una profondità di bit limitata.

4. Se l'SNR è troppo basso, riallineare gli impulsi laser per ottimizzare la sovrapposizione spaziale, la sovrapposizione temporale, la corrispondenza delle dimensioni/collimazione del fascio e/o la corrispondenza della dispersione. Per un obiettivo con un collare di correzione dell'aberrazione, ottimizzare il segnale regolando il collare di correzione.

5. Calibrazione dell'asse di frequenza

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per mettere in relazione la posizione dello stadio di ritardo con la transizione Raman scansionata. È necessaria un'attenta selezione dei solventi per generare un "righello Raman" appropriato. Il DMSO è un solvente efficace per i legami CH in quanto ha due picchi Raman acuti a 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1.

1. Salva una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1 cm. Salva le posizioni dello stadio corrispondenti al set di dati iperspettrale.
   NOTA: Il picco massimo globale dello spettro corrisponde allo spostamento Raman DMSO di 2.913 cm^-1 e il secondo picco massimo corrisponde al DMSO di 2.994 cm^-1.
2. Esegui la regressione lineare per le posizioni del palco e gli spostamenti Raman a 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1. Utilizzando l'equazione di regressione lineare che mette in relazione la posizione dello stadio con lo spostamento Raman, convertire le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti.

6. Modulazione ortogonale e imaging a due colori

NOTA: La fase di modulazione ortogonale è necessaria solo quando è necessaria l'imaging a due colori in tempo reale. Lo schema di questo schema è mostrato in Figura 5. La modulazione ortogonale utilizza una coppia di EOM pilotate a un quarto della frequenza laser (20 MHz per un laser a 80 MHz) con uno sfasamento di 90° tra i due. Questo passaggio di modulazione ortogonale può essere saltato per l'imaging SRS a colore singolo o l'imaging SRS iperspettrale.

1. Modulazione EOM1
   1. Installare un divisore di fascio polarizzatore (PBS2), una piastra a quarto d'onda (QWP2) e una seconda EOM (EOM2) nel percorso del fascio di Stokes dopo il primo EOM. Scollegare l'ingresso del segnale su EOM2. Collegare l'ingresso del segnale a EOM1 e accenderlo.
   2. Modula il raggio di Stokes (fissato a 1.040 nm) a 20 MHz (f₀/4) inviando il raggio attraverso la prima EOM. Regolare l'inclinazione e la posizione di EOM1 per assicurarsi che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
   3. Monitora la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni che escono da PBS1 con due fotodiodi e visualizzando la modulazione su un oscilloscopio.
   4. Regolare la tensione QWP1, EOM1 e la fase dell'ingresso a 20 MHz (utilizzando uno sfasato) per ottimizzare la profondità di modulazione del raggio trasmesso in modo che sia vicina al 100%. Vedi Figura 2B per un'illustrazione di una buona profondità di modulazione.
2. Modulazione EOM2
   1. Scollegare EOM1 e collegare EOM2.
   2. Invia l'uscita ad alta tensione del secondo amplificatore a 20 MHz a EOM2. Regolare l'inclinazione e la posizione di EOM2 per assicurarsi che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
   3. Ancora una volta, monitora la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni che escono da PBS2 con un oscilloscopio. Regolare la tensione QWP2, EOM2 e lo sfasatore secondo necessità per ottenere una modulazione vicina al 100% per entrambe le polarizzazioni.
   4. Assicurarsi che la modulazione del treno di impulsi abbia uno sfasamento di 90° rispetto alla prima modulazione.
      NOTA: Se i due treni di impulsi di pompa non sono ortogonali a 90°, la diafonia tra i due canali sarà un problema.
   5. Testare l'ortogonalità della modulazione accendendo e collegando sia EOM1 che EOM2. Monitora entrambe le polarizzazioni divise da PBS2 con un oscilloscopio. Riottimizzare EOM1 e EOM2 singolarmente se il treno di impulsi dopo il secondo PBS non assomiglia a Figura 2C.
   6. Installare un cristallo di quarzo birifrangente (BRC) da 20 mm e una piastra a semionda (HWP) a valle di EOM2. Collegare entrambe le EOM contemporaneamente e monitorare il treno di impulsi in modo che assomigli a Figura 2D.
      NOTA: Per il chirp utilizzato in questo esperimento, 20 mm BRC induce un ritardo temporale che corrisponde a uno spostamento Raman di 80 cm^-1. Se si utilizza un chirp diverso, potrebbe essere necessaria una lunghezza BRC diversa.
3. Calibrazione
   1. Calibrare il sistema utilizzando il DMSO rilevando i segnali dall'uscita dei canali X e Y dell'amplificatore lock-in (inviati ai canali 2 e 3 della scheda di acquisizione dati).
   2. Verificare se i segnali generati dal picco di 2.913 cm^-1 dalla polarizzazione più veloce e quelli dalla polarizzazione più lenta sono vicini a 90° fuori fase sull'amplificatore lock-in. In caso contrario, regolare l'allineamento EOM fino a quando i due segnali non sono quasi sfasati di 90°.
   3. Una volta completata la calibrazione, trovare la posizione di ritardo che sonda la transizione proteica a 2.930 cm^-1 per uno dei fasci ortogonali. Assicurarsi che l'altra polarizzazione selezioni la transizione lipidica di 2.850 cm^-1.

7. Imaging SRS in modalità epi

NOTA: Nello schema di imaging in modalità di trasmissione, l'obiettivo focalizza il laser nel campione, quindi una lente a condensatore dirige il raggio trasmesso a un fotodiodo per il rilevamento del lock-in. Nello schema di imaging in modalità epi, la luce retrodiffusa e depolarizzata dal campione viene raccolta dall'obiettivo di messa a fuoco e isolata utilizzando un divisore di fascio polarizzatore. I fotoni isolati e retrodiffusi vengono inviati a un fotodiodo attraverso una coppia di lenti relè per il rilevamento del lock-in. La Figura 6 illustra lo schema di imaging in modalità epi.

1. Installare un HWP prima che il raggio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del raggio che entra nel microscopio. Posizionare un PBS sopra l'obiettivo per consentire al raggio retroriflesso depolarizzato di raggiungere il rivelatore.
2. Utilizzare una coppia di lenti composta da una lente acromatica da 75 mm e una lente asferica da 30 mm per trasmettere i fotoni retrodiffusi dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorilevatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce retrodiffusa diretta dal PBS. Installare un filtro per impedire al raggio modulato di entrare nel rilevatore.
3. Posizionare il campione di tessuto sotto l'obiettivo. Poiché il condensatore non è necessario per l'imaging in modalità epi, rimuoverlo se è necessario più spazio.
4. Imaging
   1. Blocca il raggio con un otturatore; illuminare lateralmente il campione con una fonte di luce bianca; e usa il campo chiaro per trovare la messa a fuoco oggettiva.
   2. Sblocca entrambi i fasci e utilizza le posizioni di ritardo precalibrate per acquisire immagini SRS lipidiche e proteiche dal tessuto dalle due uscite dell'amplificatore lock-in.
   3. Regola il guadagno di blocco e il fattore di bin-in dei pixel per acquisire immagini di buona qualità.

8. Colorazione a falsi colori

1. Apri la pila di immagini con ImageJ.
2. Estrai le due immagini che corrispondono alle specie lipidiche (2.850 cm^-1) e alle proteine (2.930 cm^-1) facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e facendo clic su Duplicate.
3. Rinomina l'immagine lipidica in lipidi e l'immagine proteica in proteine.
4. Vai a Processo | Calcolatore di immagini ed esegui proteine sottrai lipidi.
5. Combina le immagini andando su Image | Colore | Unisci i canali, impostando lipidi a verde e proteine a blu. Apri lo strumento image channels (Image | Colore | Strumento Canali) e regolare la luminosità e il contrasto (Image | Regola | Luminosità/Contrasto).
6. Regola la luminosità e il contrasto per ogni canale utilizzando lo strumento canali . Per il canale lipidico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari non appaiono scure. Per il canale proteico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari non appaiono blu. Converti l'immagine verde/blu del canale unito in un'immagine RGB andando su Image | Tipologia | Colore RGB. Esporta questa immagine tramite File | Salva con nome | Tiff.
   NOTA: Per la falsa colorazione H&E, la combinazione di colori mostra il citoplasma rosa, mentre i nuclei sono blu-viola scuro.
7. Scarica lo script HE.m MATLAB dalla risorsa dello script di colorazione false H&E nel Table of Materials.
8. Esegui lo script HE.m in MATLAB. Seleziona l'immagine RGB esportata dal passaggio precedente per generare un'immagine macchiata artificialmente con H&E.
9. (FACOLTATIVO) Normalizza l'intensità dell'immagine per l'imaging con un ampio campo visivo perché l'immagine appare più scura alla periferia che al centro.
   1. Per eseguire la normalizzazione dei campi delle immagini, calcolare la media del maggior numero possibile di immagini. Quindi, rimuovere le funzioni di intensità con ImageJ (Processo | Filtri | Sfocatura gaussiana | Raggio=50).
   2. Misura l'intensità massima dell'immagine sfocata (Ctrl+M). Dividi l'immagine sfocata per l'intensità massima (Processo | Matematica | Dividere). Dividi l'immagine SRS grezza per l'immagine sfocata (Processo | Immagine | Calcolatrice).

Figura 1: Schema della configurazione di imaging SRS a un colore. Costruzione di un microscopio SRS a focalizzazione spettrale in modalità di trasmissione. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: SRS = scattering Raman stimolato; DL = linea di ritardo basata su retroriflettore; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasato; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; POM = specchio di prelievo; PBS = divisore di fascio polarizzante, BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP: piastra a semionda; PD = fotodiodo; GR = bacchetta di vetro; BB = Blocco trave; SPF = filtro passa corto; CL = lente di collimazione; BS = lente che cambia dimensione del fascio.

Figura 2: Sovrapposizione temporale rappresentativa. (A) Si vede che i fasci di pompa e di Stokes sono temporalmente sovrapposti sull'oscilloscopio. I cursori dell'oscilloscopio vengono utilizzati per contrassegnare le posizioni temporali della pompa e dei raggi di Stokes. Questa sovrapposizione è soddisfacente come punto di partenza per modificare ulteriormente la sovrapposizione temporale con una fase di ritardo. (B) Soddisfacente profondità di modulazione rappresentativa di una EOM a 20 MHz. (C) Soddisfacente modulazione di impulsi mentre due EOM sono in uso. (D) Modulazione soddisfacente del treno di impulsi dopo l'installazione del cristallo di quarzo birifrangente e della piastra a semionda sul braccio Stokes doppiamente modulato. Abbreviazione: EOM = modulatore elettroottico.

Figura 3: Segnali SRS e di pompa rappresentativi. (A) Segnale di pompa disallineato rilevato nel canale CC. (B) Segnale SRS disallineato rilevato dal fotodiodo. (C) Segnale di pompa centrato soddisfacente nel canale CC. (D) Segnale SRS soddisfacente centrato sul canale CA. Abbreviazione: SRS = scattering Raman stimolato.

Figura 4: Caratterizzazione della risoluzione spettrale. Una funzione gaussiana è stata adattata al picco Raman DMSO di 2.913 cm-1. Il FWHM calcolato ha dato una risoluzione di 15 cm-1 per il sistema. Abbreviazioni: DMSO = dimetilsolfossido; FWHM = Larghezza totale a metà massimo.

Figura 5: Schema della configurazione di imaging SRS a due colori. Costruzione di un microscopio SRS a due colori in modalità di trasmissione. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: DL = linea di ritardo basata su retroriflettore; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasato; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; PBS = divisore di fascio polarizzatore; BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP = piastra a semionda; PD = fotodiodo; GR = bacchetta di vetro; BB = Beam Block, SPF = filtro passa-corto; CL = lente di collimazione; POM = specchio di prelievo; BS = lente che cambia dimensione del fascio.

Figura 6: Schema dell'imaging SRS a due colori Epi-mode set-up. Costruzione di un microscopio SRS a due colori in modalità epi. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: DL = linea di ritardo basata su retroriflettore; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasato; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; PBS = divisore di fascio polarizzatore; BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP = piastra a semionda; PD = fotodiodo; GR = bacchetta di vetro; BB = Beam Block, BPF = filtro passa-banda; CL = lente di collimazione; POM = specchio di prelievo; BS = lente che cambia la dimensione del fascio.