Microscopia a due fotoni di astrociti e neuroni eccitatori in un tessuto ippocampale di topo cancellato

Abstract

Fonte: Refaeli, R., et al., Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni in cervelli chiariti. J. Vis. Exp. (2022)

Il video mostra la preparazione di una camera e il neuroimaging del tessuto ippocampale di topo ripulito utilizzando la microscopia a due fotoni per visualizzare le interazioni spaziali tra astrociti marcati in fluorescenza e neuroni eccitatori.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione della camera

NOTA: Ogni campione richiede un vetrino con una camera di imaging in cui verrà posizionato il campione.

1. Posizionare il campione al centro del vetrino.
2. Utilizzando una pistola per colla a caldo, creare pareti ai bordi dello scivolo, alte quasi quanto il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio (circa 5 mm) in uno degli angoli (Figura 1A, B).
3. Applicare 1-2 gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione o RIMS sul campione per mantenere umida la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle tra il vetrino coprioggetti e il tessuto.
4. Subito dopo aver applicato le gocce RIMS (Refractive index matching solution), aggiungere l'ultimo strato di colla a caldo alle pareti (in modo che raggiungano l'altezza del cervello/fetta) e procedere immediatamente (mentre la colla a caldo è ancora liquida) al passaggio 1.5.
5. Sigillare la parte superiore con un vetrino coprioggetti, posizionandolo il più uniformemente possibile sulla parte superiore dello strato di colla a caldo ancora caldo (Figura 1C).
6. Riempire la camera con i RIMS attraverso lo spazio lasciato nelle pareti di colla a caldo (Figura 1D, E).
7. Chiudi lo spazio con la colla a caldo. Non lasciare aria all'interno (Figura 1F).
8. Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi del vetrino, tagliare i bordi di estensione (Figura 1G).
9. Se l'obiettivo utilizzato per l'imaging è immerso, aggiungere altri 2-3 mm di colla alle pareti sopra il vetrino coprioggetti in modo che la soluzione di immersione duri più a lungo (Figura 1H).

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti AAV1-GFAP::TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF) Vettore virale utilizzato per rilevare gli astrocitiAAV5-CaMKII::eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF) Vettore virale utilizzato per rilevare i neuroniAAV5-CaMKII::H2B-eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF) Vettore virale utilizzato per rilevare i nuclei neuronaliAAV5-CaMKII::TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF) Vettore virale utilizzato per rilevare i neuroniImaris softwareBitplane, UK Un software che permette l'analisi 3D delle immaginiRapiClearSunJin lab#RC147002 RapiClear CSSunJin lab#RCCS002 SyGlass software Un software che consente l'analisi 3D delle immagini utilizzando la realtà virtualeMicroscopio a due fotoniNeurolabwareTi:laser zaffiro (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubi fotomoltiplicatori GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), obiettivo 16x ad immersione in acqua (Nikon, 0.8 NA)VA-044 InitiatorWako#011-19365