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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Analisi morfologiche di neuroni di granuli cerebellari o CGN - ricostruzione tridimensionale (3D) e area superficiale e volume cellulare
- Immagine di singole CGN elettroporate su un microscopio confocale con obiettivo 63x con zoom 2x, scattando immagini z-stack a 0,5 μm per stack. Immagine di una cella per finestra dell'immagine per consentire una facile analisi e ricostruzione dell'immagine.
- Installare il plug-in Simple Neurite Tracer per FIJI utilizzando il seguente link (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) per tracciare in modo semplice ed efficiente la struttura delle CGN elettroporate nello spazio tridimensionale (3D).
NOTA: Esiste una versione aggiornata del plug-in (https://imagej.net/SNT).
- Analizza la lunghezza dei neuriti e la formazione degli artigli dendritici in cieco utilizzando un semplice tracciante neurite. Carica immagini z-stack a canale singolo di CGN elettroporate su FIJI e fai clic su Plugin | Segmentazione | Tracciante neurite semplice (Figura 1D).
- Accedere al menu a discesa e selezionare Crea nuovo visualizzatore 3D (Figura 1D).
- Scorri fino alla base di un dendrite, dove si collega al soma cellulare, e inizia un percorso facendo clic sulla giunzione. Tracciate manualmente il percorso facendo clic sulle sezioni in cui il segnale di riempimento della cella è più luminoso, premendo [y] per mantenere la traccia. Tracciare fino alla fine del dendrite se non contiene un artiglio o fino alla base dell'artiglio e confermare il percorso premendo [f] (Figura 2D).
- Successivamente, traccia l'artiglio iniziando un percorso alla base della struttura e tracciando fino alla fine del neurite più lungo. Traccia rami secondari e terziari tenendo premuto [ctrl] su Windows o [alt] su Mac OS e facendo clic sul percorso. Confermare il percorso premendo [f].
- Si noti che le misure per le tracce sono visibili su una finestra separata; Somma tutte le misure dei rami dell'unghia (primaria, secondaria, terziaria) per ottenere la lunghezza totale per ogni unghia.
- Per analizzare l'area superficiale e il volume cellulare dei CGN elettroporati, scarica il software di analisi cellulare Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
NOTA: FIJI può anche essere utilizzato per ricostruire celle in 3D da immagini z-stack utilizzando plug-in prontamente disponibili e gratuiti. Inoltre, Simple Neurite Tracer ha una funzione di rendering volumetrico, ma Imaris è stato utilizzato per i motivi descritti di seguito.
- Carica un'immagine z-stack di una CGN elettroporata su Imaris. Accedi al toolkit di ricostruzione 3D premendo Surpass.
- Per ricostruire la CGN, premere Superfici e selezionare un'area di interesse che comprenda l'intera cella all'interno della finestra dell'immagine. Una volta terminato, premi la freccia blu in avanti nell'angolo in basso a destra sotto Crea.
- Se l'immagine contiene più canali per segnali diversi, selezionare il canale contenente la CGN elettroporata e premere la freccia blu in avanti.
- Utilizzando la barra laterale, impostare una soglia desiderata che si adatti più accuratamente al segnale della cella elettroporata. Ingrandisci la superficie della cella per determinare con precisione la soglia. Una volta terminato, premere la doppia freccia verde per ricostruire la cella e ottenere la superficie e la dimensione del volume dai metadati.
