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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Imaging in vivo a due fotoni della microglia e della dinamica del calcio neuronale
1. Assuefazione dei topi all'apparecchio del microscopio
- Tre settimane dopo l'intervento, indurre l'anestesia nel topo con isoflurano al 3% e posizionare il topo sotto la lente dell'obiettivo 25x di un microscopio a due fotoni utilizzando uno strumento stereotassico su misura (Figura 1C). Per la configurazione, il mouse è posizionato sulla parte superiore di un tapis roulant e può correre liberamente.
- Circa 10 minuti dopo, rimuovere il topo dal tavolino del microscopio e rimetterlo nella gabbia di casa. Ripetere l'assuefazione almeno 3 volte a giorni alterni prima dell'acquisizione dell'immagine a due fotoni.
2. Acquisizione dell'immagine a due fotoni
NOTA: Si consiglia di eseguire l'acquisizione dell'immagine più di 4 settimane dopo l'intervento chirurgico, poiché l'attivazione microgliale ritorna gradualmente al livello basale.
- Indurre l'anestesia nel topo con isoflurano al 3% e posizionare il topo sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni utilizzando uno strumento stereotassico su misura.
- Installare il dispositivo di ombreggiamento su misura (Figura 1A e Figura 1B) e un monitor LCD per la stimolazione visiva come descritto di seguito (Figura 1D).
- Posiziona la lente per mettere a fuoco la superficie del cervello, e poi imposta questa posizione della lente come posizione Z originale. Mantenere costanti le coordinate x-y ed elevare la lente dell'obiettivo; Rimuovere il mouse e lo strumento stereotassico dalla lente dell'obiettivo e dal tapis roulant.
- Fissare un dispositivo di ombreggiatura sulla parte superiore della piastra di testa utilizzando del silicone, che viene annerito mescolandolo con polvere di carbone, e assicurarsi che lo spazio tra la piastra di testa e il dispositivo di ombreggiatura sia ben sigillato.
- Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua distillata, quindi fissare nuovamente il mouse e la cornice stereotassica sotto l'obiettivo e sul tapis roulant. Reimpostare con cura il piano focale sulla superficie del cervello, controllando la profondità della lente dell'obiettivo.
NOTA: Per evitare il rischio di danneggiare la lente dell'obiettivo, impostare prima le coordinate xyz, quindi applicare il dispositivo di ombreggiatura della lente dell'obiettivo. È anche ragionevole installare prima il coperchio e quindi regolare le coordinate, ma per questa opzione è necessaria una gestione cauta. - Coprire la lente dell'obiettivo con un foglio di alluminio nero per evitare la contaminazione della luce dal monitor LCD utilizzato per la stimolazione visiva attraverso la lente dell'obiettivo (Figura 1D). Posizionare un monitor LCD da 10 pollici a 12,5 cm davanti agli occhi del mouse per presentare gli stimoli visivi (Figura 1D).
- Configura i filtri di raccolta dell'emissione di fluorescenza in fluorescenza EGFP (filtro di emissione 525/50 nm) e fluorescenza R-CaMP (filtro di emissione 593/46 nm) e la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nm. Acquisisci immagini con una risoluzione spaziale di 0,25 μm/pixel utilizzando un obiettivo 25x 1,1 NA e PMT GaAsP.
- Trova la regione di imaging in cui i neuroni R-CaMP (+) e la microglia EGFP (+) possono essere visualizzati contemporaneamente nello strato 2/3. Per questa configurazione, i dati ottenuti nella Figura 2 erano a una profondità di 100 μm dalla superficie del piale, utilizzando un'anteprima dell'immagine dal vivo. Mantenere la potenza del laser di eccitazione il più bassa possibile per evitare il fotosbiancamento e i danni causati dall'aumento della temperatura locale nella regione di imaging.
- Acquisizione di immagini alla frequenza di fotogrammi di 30 Hz. Contemporaneamente all'acquisizione dell'immagine, è possibile presentare uno stimolo visivo a reticolo al 100% di contrasto, 1,5 Hz, 0,04 cicli per grado in 12 direzioni a 6 orientamenti da 0° a 150° con incrementi di 30° fino al mouse.
- Dopo l'acquisizione dell'immagine, rimuovere il mouse dal tavolino del microscopio, staccare il dispositivo di ombreggiatura e lo strumento stereotassico dal mouse e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
