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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica animale appropriato. 1. Elaborazione dei tessuti
NOTA: Dopo la perfusione transcardica e la postfissazione in paraformaldeide al 4% (PFA) diluita in tampone fosfato 0,2 M durante la notte a 4 °C, i cervelli vengono trasferiti al 30% di saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per tre giorni a 4 °C. Successivamente, i cervelli vengono congelati su ghiaccio secco in polvere e conservati a -80 °C fino al sezionamento.
- Separa gli emisferi destro e sinistro lungo la linea mediana del cervello usando un bisturi. Quindi, scegli l'uno o l'altro emisfero a caso nel primo cervello. Successivamente, passa sistematicamente tra gli emisferi destro e sinistro (Figura 1A). Montare l'emisfero campionato su un disco campione con l'asse lungo perpendicolare al disco utilizzando un mezzo di montaggio.
- Posizionare i contenitori multipiatto numerati per il pre-raffreddamento nel criostato.
- Monta il disco del campione nel criostato e taglia l'intero ippocampo (Bregma da 1,80 a - 7,04) in sezioni spesse 80 μm nel piano coronale (Figura 1B).
- Posiziona tutte le sezioni campionate consecutivamente nei contenitori multi-piatto raffreddati per mantenere le sezioni in ordine di taglio.
- Coprire completamente le sezioni con crioprotettore e tenere i contenitori a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
2. Immunocolorazione
NOTA: Per tenere traccia delle singole sezioni durante la procedura di colorazione, posiziona le sezioni campionate in reti di colorazione a 25 pozzetti. Utilizzare ogni 5 sezioni, fornendo un numero finale medio di 12 (8-16) sezioni per ippocampo per l'immunocolorazione e il successivo conteggio delle cellule.
- Prima di sottocampionare ogni ennesima sezione con un inizio casuale tra le sezioni uno e n (Figura 1C), trasferire i contenitori da -20 °C a temperatura ambiente (RT).
- Utilizzare un pennello, ad esempio, per trasferire le sezioni in ordine numerico alle reti di colorazione a 25 pozzetti poste in piastre di Petri riempite con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Da questo punto, conservare le sezioni delle reti coloranti poste in piastre di vetro abbinate su un agitatore orbitale (sezioni da 2.3 a 2.9). - Trasferisci le reti coloranti nelle piastre di vetro corrispondenti e lava le sezioni due volte per 10 minuti in PBS a temperatura ambiente (RT) prima dell'incubazione in perossido di idrogeno al 3% (H2O2) diluito in acqua distillata (dH2O) per 20 min.
- Trasferire le sezioni in tre diverse soluzioni di acido cloridrico (HCl) (1 M a 0 °C per 10 minuti, 2 M a RT per 10 minuti e 2 M a 37 °C per 20 minuti) prima di neutralizzare in tetraborato di sodio 0,1 M a RT per 20 minuti.
- Dopo 3 × 10 minuti di incubazione in Triton X-100 all'1% diluito in PBS (tampone di lavaggio), trasferire le sezioni in un tampone di lavaggio contenente il 10% di siero fetale bovino (soluzione bloccante) per 1 ora a RT.
- Incubare le sezioni per 48 ore a 4 °C in soluzione di topo-anti-BrdU (5-bromo-2'-deossiuridina) diluito 1:100 in soluzione bloccante.
- Lavare le sezioni per 3 × 10 minuti in tampone di lavaggio e incubare per 48 ore in perossidasi di rafano diluita 1:10 in tampone di lavaggio.
- Trasferisci le sezioni su PBS per 5 × 10 minuti e poi per 7 minuti in diaminobenzidina (DAB) allo 0,01% diluita in PBS prima di essere trasferita a una soluzione DAB simile contenente lo 0,02% di H2O2 per 10 minuti a RT.
- Completare una serie di lavaggi (2 × 10 min in PBS e 2 × 10 min in tampone fosfato senza aggiunta di cloruro di sodio) e montare le sezioni in ordine numerico su vetrini da microscopio.
- Asciugare le sezioni per circa 30 minuti prima di controcolorare con la violetta cresillarica.
- Posizionare i vetrini del microscopio in un rack per vetrini.
- Reidrata le sezioni per 10 minuti in piatti per la colorazione dei vetrini contenenti dH2O, e poi trasferisci le diapositive allo 0.02% di cresil viola in dH2O per 15 min.
- Ripetere il passaggio 2.12 prima che le sezioni siano disidratate tre volte in etanolo (96% per 5 minuti e 99% per 2 × 2 minuti).
- Posizionare le sezioni nello xilene per 2 × 15 minuti e applicare i vetrini utilizzando un mezzo ad asciugatura rapida per il montaggio.
- Infine, lasciare i vetrini scivolati per circa 24 ore prima di poter essere utilizzati per la microscopia.
3. Stima del numero totale di neuroni marcati con BrdU utilizzando il frazionatore ottico
NOTA: Conduci uno studio pilota che includa alcuni animali per determinare i parametri di campionamento ottimali, come il numero di sezioni da analizzare e il numero di dissettori ottici all'interno delle sezioni campionate. Questo pilota fornisce anche un CV preliminare (deviazione standard/media) e la possibilità di regolare il CE per ottenere una precisione soddisfacente delle stime determinate dallo sperimentatore (per maggiori dettagli, vedi sotto). Allo stesso modo, un'analisi della distribuzione z affronterà i seguenti punti: restringimento del tessuto, qualità della colorazione in tutta la sezione e distribuzione delle cellule sull'asse z.
- Controlla lo spessore del tessuto nelle sezioni per confermare che sono adatte all'uso del frazionatore ottico, ad esempio, abbastanza spesse per l'altezza del dissettore scelto, comprese le zone di protezione (vedi sotto). NOTA: Lo spessore del tessuto viene misurato in diversi punti all'interno della regione di interesse.
- Posiziona i vetrini sul tavolino motorizzato del microscopio e accendi il software stereologico preferito.
- Delinea l'area di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (2X o 4X) prima di passare a un obiettivo a immersione in olio 100X (vedi Figura 2A).
- Utilizzo di un punto specifico di un fotogramma di conteggio (es., in corrispondenza o adiacente a un angolo), individuare la parte superiore della sezione spostandosi lungo il piano focale fino a quando non viene messa a fuoco una funzione di sezione. Registra questa posizione z come 0 (vedi Figura 2B).
- Spostare il piano focale verso il basso attraverso il tessuto fino a quando lo stesso punto specifico del telaio di conteggio si trova all'ultimo livello z del tessuto a fuoco e segnare questa posizione. Lo spessore del tessuto locale è definito da 0 a questo punto finale e può essere letto sull'asse z. Registra lo spessore del tessuto (vedi Figura 2B).
- Documentare la piena penetrazione della macchia e la distribuzione delle cellule nell'intero spessore della sezione.
NOTA: La distribuzione dei neuroni marcati con BrdU viene utilizzata come guida per determinare le zone di guardia richieste. Sebbene una distribuzione uniforme delle cellule sia fondamentale, è accettabile osservare un minor numero di cellule vicino alla parte superiore e inferiore della sezione, indicando l'effetto della perdita dei cappucci.- Campiona i neuroni marcati con BrdU e registra la loro posizione z insieme allo spessore della sezione locale misurato nell'angolo selezionato di ogni fotogramma di conteggio.
- Traccia il numero di neuroni BrdU-positivi in funzione della loro posizione z.
- L'altezza delle zone di direzione e di protezione deve essere fissata in base allo spessore medio della sezione e alla distribuzione delle celle (vedi 3.1 e 3.2).
NOTA: L'altezza del dissettore deve essere inferiore allo spessore della sezione per evitare artefatti vicino alle superfici. Questo rischio viene aggirato includendo zone di protezione nella parte superiore e inferiore della sezione. - Determinare la lunghezza del passo tra i dissettori.
- Delinea la regione di interesse su tutte le sezioni da analizzare e registra le aree.
- Somma queste aree e dividi per il numero di dissettori collocati all'interno di quest'area.
NOTA: Sulla base dell'esperienza precedente, un buon punto di partenza prevede 75 sonde. Questo approssima l'area e le corrispondenti posizioni di campionamento (Astep). - Prendi la radice quadrata di Apasso, che fornirà la dimensione del passo x-y.
- Determinare le dimensioni del telaio di conteggio.
- Imposta la dimensione del frame di conteggio su un'unità arbitraria ed esegui un campionamento pilota di neuroni BrdU-positivi utilizzando i parametri ottenuti nelle sezioni 3.3 e 3.4.
NOTA: La dimensione deve essere determinata empiricamente per tentativi ed errori, ma si consiglia di effettuare una regolazione per consentire il campionamento di 2-3 cellule per dissettore.
- Dopo questa fase finale dello studio pilota, iniziare il campionamento cellulare.
NOTA: I parametri di campionamento ottenuti dovrebbero portare a conteggi di circa 150-200 cellule in ciascun animale, sufficienti per ottenere un efficiente disegno stereologico. - Contare i neuroni BrdU-positivi utilizzando un obiettivo a immersione in olio al 100× e un ingrandimento finale di 2000-3000×. In ogni dissettore ottico, identificare tutti i neuroni marcati con BrdU che sono riconosciuti dalla caratteristica di interesse (nel presente studio, il criterio è quando il bordo anteriore del neurone marcato con BrdU viene messo a fuoco per la prima volta), si trovano all'interno del frame di conteggio o toccano le linee di inclusione (Figura 2B). Non contare i neuroni BrdU-positivi che toccano le linee di esclusione quando sono chiaramente riconosciuti dalla caratteristica di interesse all'interno dell'altezza del dissettore. È di fondamentale importanza seguire attentamente queste regole di conteggio durante l'intera quantificazione stereologica.
NOTA: Poiché BrdU si incorpora in tutte le cellule in divisione, la morfologia distingue tra neuroni e altri tipi di cellule. Le caratteristiche dei neuroni sono un nucleo chiaramente definito con un citoplasma neutro e un nucleolo scuro. Le cellule BrdU-positive sono riconosciute come neuroni di nuova formazione in base alle loro dimensioni maggiori rispetto alle cellule gliali. Negli studi sulla proliferazione a breve termine (ad esempio, < 2,4 ore), la doppia colorazione con marcatori neuronali immaturi può essere un prerequisito.
