1. Imaging a fluorescenza
- Immagine della Drosophila preparazione di pupe utilizzando un microscopio fluorescente. Ogni 7 minuti catturare sezioni seriali attraverso il dominio apicale del neuroepitelio oculare, nella regione delle giunzioni aderenti.
NOTA: a) Le sezioni seriali appropriate sono solitamente 4-5 per z-stack, composte da z-step di 0,2 μm. b) Le irregolarità nella topologia dell'epitelio, comprese lievi protuberanze e pieghe, possono rendere difficile l'acquisizione di immagini a fuoco di ampie regioni di tessuto. Durante l'imaging, si può scoprire che parte di un'area di interesse è a fuoco e una regione vicina è fuori fuoco. L'inclusione di una piccola goccia di acqua distillata tra l'occhio della pupa e il vetrino coprioggetti può eliminare alcune pieghe acute del tessuto, ma non la topologia leggermente irregolare caratteristica delle prime fasi della morfogenesi dell'occhio della pupa. In questi casi, sovracampionare il tessuto estendendo lo z-stack fino a quando non vengono acquisite fette a fuoco per l'intero campo. c) L'acquisizione di sezioni seriali ogni 7 minuti dovrebbe consentire l'imaging dal vivo per 3 o 4 ore senza una riduzione significativa dell'intensità della fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) che potrebbe compromettere la qualità dell'immagine. Intervalli di tempo più brevi possono ridurre il tempo totale di imaging. - Continuare l'imaging per 3 o 4 ore. Non utilizzare una funzione di messa a fuoco automatica e tempo disponibile su molti microscopi a fluorescenza poiché la crescita della pupa e il pompaggio dell'emolinfa spostano la posizione della retina e la rimessa a fuoco vigile è necessaria ogni 14-21 minuti.
NOTA: L'imaging oltre le 4 ore può rallentare o bloccare la morfogenesi dell'occhio.
- Utilizzare un software di deconvoluzione appropriato per ridurre lo sfondo e migliorare il contrasto delle immagini della sezione seriale. Per ogni file z-stack, eseguire le seguenti operazioni nel software a fluorescenza avanzata (LAS AF) della suite di applicazioni Leica: Passare al pannello Strumenti, selezionare Deconvoluzione 3D e fare clic su Applica.
- Generare un'immagine di proiezione massima (MP) per ogni file stack deconvoluto: Passa al pannello Strumenti, seleziona Proiezione 3D e fai clic su Applica.
NOTA: L'algoritmo MP potrebbe non riuscire a generare un'immagine uniformemente a fuoco per il tessuto che è stato sovracampionato.
2. Elaborazione delle immagini
- Allineamento automatico delle immagini:
NOTA: Il tessuto Drosophila si sposterà e crescerà durante il processo di imaging. Di conseguenza, i centri delle immagini raccolte in punti temporali successivi potrebbero non corrispondere allo stesso punto nel tessuto Drosophila. Inoltre, l'intero disco retinico ruota di circa 30° tra ~21 e 23 ore dopo la formazione del pupario (APF). Per evidenziare i comportamenti delle singole cellule e ridurre le distrazioni causate dalla crescita dell'organismo, allineare ogni immagine MP. Sebbene ciò possa essere eseguito manualmente, il software di modifica delle immagini utilizzato qui dispone di algoritmi integrati che possono accelerare il processo.
- Dalla scheda File del menu principale, apri Script e seleziona Carica file in pila.
- Importate i file di immagine MP nel pannello Carica livelli e selezionate OK. Assicuratevi che l'opzione Tentativo di allineamento delle immagini sorgente non sia selezionata automaticamente.
- NOTA: Se questa opzione è selezionata, il software potrebbe utilizzare un algoritmo di allineamento che distorce i dati dell'immagine.
- Una volta caricati tutti i file MP nel riquadro Livelli, assicuratevi che tutte le immagini siano in ordine cronologico in modo che il primo punto temporale si trovi in cima alla pila di livelli. Se i livelli non sono nell'ordine corretto, trascinali e rilasciali fino a quando non sono ordinati correttamente.
- Seleziona Allinea automaticamente i livelli dalla scheda Modifica del menu principale. Scegliere Riposiziona e fare clic su OK.
- Se l'algoritmo di allineamento automatico non riesce a orientare i fotogrammi verso un punto focale pertinente, apportare piccole regolazioni utilizzando lo strumento Sposta.
