Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo

Abstract

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo, mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della sessione di imaging
2. Accendere la configurazione di imaging in anticipo e lasciare che il laser si riscaldi e si stabilizzi, se necessario.
3. Anestetizzare il topo. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia al 3% di isoflurano in 1 L/min O₂ e attendere che perda conoscenza. Valutare l'anestesia utilizzando il test del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
4. Utilizzare una pinza per rimuovere con cautela la pellicola adesiva dalla piastra di supporto della testa. Tenere il mouse in una mano e la piastra di supporto della testa con le dita. Rimuovere la pellicola delicatamente, per evitare di danneggiare la preparazione.
5. Posizionare il mouse sotto il microscopio, sopra il tappeto riscaldante, e fissare la piastra della testa al supporto (Figura 1D).
6. Posizionare il cono del naso in modo da coprire il muso e ridurre l'isoflurano all'1,5-2%.
7. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo.
8. Pulire la cannula di imaging sciacquandola con acqua deionizzata. Usa una siringa e un ago sottile per far cadere l'acqua nella cannula e una pompa a vuoto per rimuoverla.

2. Sessione di imaging

1. Utilizzare obiettivi a basso ingrandimento e a lunga distanza di lavoro per controllare visivamente la cannula per verificare la presenza di acqua residua, sporco, integrità e presenza di fluorescenza.
2. Allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del supporto della testa.
3. Passa agli obiettivi a immersione in acqua 25X 1,0 NA (apertura numerica), 4 mm WD (distanza di lavoro) o 40X 0,8 NA, 3 mm WD. Aggiungere abbastanza acqua deionizzata per riempire la cannula e mantenere l'acqua in eccesso sopra la cannula. Evitare la formazione di bolle d'aria.
4. Utilizzare segnali di eccitazione a due fotoni (2P) e segnali fluorescenti dell'immagine.
   NOTA: Il protocollo di imaging dipende fortemente dalle scale temporali e spaziali da riprendere. Si prega di fare riferimento ai risultati rappresentativi della sezione e alla discussione per i dettagli sulle impostazioni di imaging che abbiamo utilizzato per produrre le immagini mostrate in questo articolo.

Risultati

Materiali