Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo

Abstract

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo, mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della sessione di imaging
2. Accendere la configurazione di imaging in anticipo e lasciare che il laser si riscaldi e si stabilizzi, se necessario.
3. Anestetizzare il topo. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia al 3% di isoflurano in 1 L/min O₂ e attendere che perda conoscenza. Valutare l'anestesia utilizzando il test del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
4. Utilizzare una pinza per rimuovere con cautela la pellicola adesiva dalla piastra di supporto della testa. Tenere il mouse in una mano e la piastra di supporto della testa con le dita. Rimuovere la pellicola delicatamente, per evitare di danneggiare la preparazione.
5. Posizionare il mouse sotto il microscopio, sopra il tappeto riscaldante, e fissare la piastra della testa al supporto (Figura 1D).
6. Posizionare il cono del naso in modo da coprire il muso e ridurre l'isoflurano all'1,5-2%.
7. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo.
8. Pulire la cannula di imaging sciacquandola con acqua deionizzata. Usa una siringa e un ago sottile per far cadere l'acqua nella cannula e una pompa a vuoto per rimuoverla.

2. Sessione di imaging

1. Utilizzare obiettivi a basso ingrandimento e a lunga distanza di lavoro per controllare visivamente la cannula per verificare la presenza di acqua residua, sporco, integrità e presenza di fluorescenza.
2. Allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del supporto della testa.
3. Passa agli obiettivi a immersione in acqua 25X 1,0 NA (apertura numerica), 4 mm WD (distanza di lavoro) o 40X 0,8 NA, 3 mm WD. Aggiungere abbastanza acqua deionizzata per riempire la cannula e mantenere l'acqua in eccesso sopra la cannula. Evitare la formazione di bolle d'aria.
4. Utilizzare segnali di eccitazione a due fotoni (2P) e segnali fluorescenti dell'immagine.
   NOTA: Il protocollo di imaging dipende fortemente dalle scale temporali e spaziali da riprendere. Si prega di fare riferimento ai risultati rappresentativi della sezione e alla discussione per i dettagli sulle impostazioni di imaging che abbiamo utilizzato per produrre le immagini mostrate in questo articolo.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo in acciaio inossidabile Ø 3,0 x 0,25 mm (Ø interno 2,5 mm ) L = 500 mm	Sawade	R00303	Tubo in acciaio inossidabile per l'anello metallico della cannula
Vetro di copertura del microscopio (4 mm rotondo)	Engelbrecht Medizin e Labortechnik	<
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquido isoflurano per anestesia
Vaporizzatore di riempimento a imbuto isoflurano dell'apparato di Harvard	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Vaporizzatore isoflurano
Lab Scavenger attivo	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurano sistema di scavenger
Regolatore di temperatura CMA 450	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Coperta riscaldante
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG	<
Piastre di testa	Personalizzato made		30 mm x 10 mm dimensione; foro diametro 8 mm, titanio
Morsetto piastra	Custom made		Head plate holder
Supporti per pali su piedistallo	Thorlabs	PH20E/M	Supporto piastra
Post in acciaio inossidabile	Thorlabs	TR30/M	Supporto piastra
Post in acciaio inossidabile	Thorlabs	TR75/M	Supporto piastra
Post in acciaio inossidabile	Thorlabs	TR150/M	Supporto piastra
Morsetti connettore post	personalizzato		Supporto piastra testa
Breadboard in alluminio, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, Rubinetti M6	Thorlabs	MB3045/M	Tavolino
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	Tavolino
Maschera facciale a basso profilo topolini	Emka Technologies	VetFlo-0801	Supporto maschera facciale per anestesia
Misuratore di potenza Modello 1918-R	Newport		Misuratore di potenza
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		Lampada a fluorescenza
Microscopio a due fotoni	Bruker	Ultima IV	Microscopi a due fotoni
Microscopio a due fotoni	Thorlabs	Bergamo	Microscopi a due fotoni
Piano N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Obiettivi
Piano N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Obiettivi
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Obiettivi
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Obiettivi
Laser sintonizzabile Ultafast per eccitazione 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Eccitazione laser
Laser sintonizzabile Ultafast per eccitazione 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Eccitazione laser
Laser sintonizzabile Ultafast per eccitazione 3P	Coherent	Monaco	Eccitazione laser

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