Indagine sulle origini dei neuroni sensoriali nella dura madre mediante microscopia a fluorescenza

Abstract

Fonte: Wang, J., et al. Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva del peptide correlato al gene della calcitonina della dura madre cranica di ratto con immunofluorescenza e tracciamento neurale. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un metodo per tracciare le origini dei neuroni sensoriali nella dura madre utilizzando la microscopia a fluorescenza. Un tracciante retrogrado viene introdotto nella dura madre esposta di un ratto anestetizzato. Il tracciante viene assorbito dagli assoni neuronali sensoriali e viaggia retrogradamente verso i loro corpi cellulari all'interno del ganglio trigemino e dei gangli della radice dorsale cervicale. I gangli vengono quindi sezionati, colorati con anticorpi che marcano il tracciante e i neuropeptidi nei corpi cellulari e analizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza per confermare le origini gangliari dei neuroni sensoriali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Studio di tracciamento retrogrado con fluorogold (FG)

1. Procedure chirurgiche
   1. Determinare l'area di coordinate di interesse nella dura madre cranica di ratto.
   2. Preparare una micro-siringa da 10 μl e testarla con paraffina liquida.
   3. Anestetizzare i ratti con una soluzione di tribromoetanolo (150 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale. Controllare la profondità in anestesia in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
   4. Radi la testa del topo con un rasoio elettrico.
   5. Metti delle barre auricolari smussate sul ratto e posizionale sul dispositivo stereotassico. Quindi metti il supporto per la bocca e applica l'unguento oftalmico sugli occhi.
   6. Pulire il sito chirurgico della pelle della testa utilizzando il 10% di iodio povidone seguito da etanolo al 75%.
   7. Fai un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
   8. Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone (Figura 1A).
   9. Praticare un piccolo foro (~5-7 mm) utilizzando un trapano a fresa con una punta a punta tonda (#106) sulle ossa parietali e temporali sinistre sopra l'arteria meningea media (MMA) e assicurarsi che la dura madre cranica sia stata mantenuta intatta (Figura 1B).
   10. Costruire un banco attorno al foro con cemento silicato dentale per limitare la diffusione del tracciante (Figura 1C).
   11. Aggiungere 2 μL di FG al 2% nel foro intorno all'MMA con una micro-siringa da 10 μL (Figura 1D).
   12. Coprire il foro con un pezzettino di spugna emostatica.
   13. Mettere un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigillare i bordi con cera ossea per evitare la fuoriuscita del tracciante e per evitare di contaminare i tessuti circostanti.
   14. Suturare la ferita con filo sterile.
   15. Tieni i ratti in una zona calda fino a quando non si saranno completamente ripresi.
   16. Rimetti i ratti nelle loro gabbie e aggiungi un antibiotico e un analgesico nell'acqua potabile.
2. Perfusioni e sezioni
   1. Dopo 7 giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti.
   2. Sezionare il ganglio del trigemino (TG) e i gangli della radice dorsale C1-4 (DRG), quindi post-fissarli e crioproteggerli (Figura 1F).
   3. Tagliare i TG e i DRG allo spessore di 30 μm su un sistema di microtomo criostato in direzione sagittale e montati su vetrini rivestiti di silano.
3. Doppia immunofluorescenza per la marcatura dei peptidi correlati ai geni FG e calcitonina (CGRP) nei TG e nei DRG
   NOTA: Sebbene la marcatura FG possa essere osservata direttamente con l'illuminazione ultravioletta (UV) sotto lampada al mercurio senza ulteriori colorazioni, i neuroni marcati con FG sono stati ulteriormente esaminati nei DRG TG e cervicali utilizzando doppie immunofluorescenze con FG e CGRP per rivelare le origini delle fibre nervose durali CGRP-immunoreattive nei TG e nei DRG.
   1. Cerchia le sezioni con la penna istochimica.
   2. Incubare le sezioni per 30 minuti in una soluzione bloccante contenente il 3% di siero d'asino normale e lo 0,5% di Triton X-100 in tampone fosfato 0,1 M (PB).
   3. Trasferire i campioni nella soluzione di anti-fluorogold di coniglio (1:1000) e anticorpo anti-CGRP di topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero d'asino normale e lo 0,5% di Triton X-100 durante la notte a 4 °C.
   4. Lavare le sezioni tre volte a 0,1 M PB il giorno seguente.
   5. Incubare in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 594 (1:500) e Alexa Fluor 488 (1:500) anti-topo asino in 0,1 M PB contenente l'1% di siero d'asino normale e lo 0,5% di Triton X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente.
   6. Lavare e applicare i vetrini coprioggetti sulle sezioni.
4. Osservazione e registrazione
   1. Scatta immagini dei neuroni marcati con FG in TG e DRG sotto illuminazione UV con un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale.
   2. Cattura immagini dei neuroni marcati con FG e CGRP in TG e DRG con un microscopio a fluorescenza dotato di fotocamera digitale.
   3. Utilizzare il software di editing per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e per aggiungere etichette alle immagini.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protegge dalla luce; RRID: AB_141607Strumento per stereotassi cerebraleNarishigeSR-50 CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software del microscopio fluorescenteFluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Proteggi dalla luceSistema di imaging fluorescenteOlympusBX53 Microtomo di congelamentoThermoMicrom InternationalGmbH Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7 Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411Normal siero d'asinoJackson ImmunoResearch017-000-121 Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Proteggi dalla lucePhotoshop e IllustrazioneAdobeCS6Software di fotoritoccoRabbit anti-FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013 Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-001<td style='overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;vertical-align:bottom;'>25x75x1mm