Monitoraggio del recupero delle cellule interneuromast ablate con laser in zebrafish mediante microscopia confocale

1. Imaging post-ablazione e microscopia time-lapse per studiare la rigenerazione

1. Clicca sul menu a tendina per "Canali". Nei canali, deselezionare la traccia "DAPI"(4′,6-diamidino-2-fenilidolo) per disattivare il laser di ablazione. Fare clic sul menu a discesa per "Modalità di acquisizione".
2. In modalità di acquisizione, fare clic su "Zoom".
3. Riduci lo zoom a 0,7 utilizzando il cursore o digitando "0,7."
   1. Per garantire il successo dell'ablazione cellulare, aumenta il guadagno a 900 e scansiona rapidamente il campo visivo.
      NOTA: Nessuna GFP (proteina fluorescente verde) dovrebbe essere visibile all'interno della cellula o delle cellule bersaglio. Utilizzando le stesse impostazioni o impostazioni simili a quelle descritte per l'imaging pre-ablazione, acquisire e salvare un'immagine post-ablazione (Figura 1C). Se l'immagine rivela resti di cellule fluorescenti o corpi cellulari aggiuntivi che devono essere rimossi, ripetere i passaggi dell'ablazione laser per creare uno spazio visibile nella stringa di cellule interneuromastiche.
   2. Ispezionare l'immagine del canale T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube) per confermare ulteriormente il danno cellulare. Le cellule danneggiate avranno un aspetto granulare e i nuclei si gonfieranno frequentemente o diventeranno di forma irregolare (Figura 2).
4. Dopo aver acquisito un'immagine pre-ablazione, aver ablato le cellule secondo necessità e aver acquisito un'immagine post-ablazione per ogni singola posizione dello stadio, impostare la microscopia time-lapse attivando sia la posizione dello stadio che le opzioni temporali per l'acquisizione dell'immagine. Impostare i parametri temporali su 24 ore o un altro punto finale desiderato e intervalli di 15 minuti. Avviare l'esperimento per acquisire le immagini e salvare il file risultante al termine (il giorno successivo).
5. Se le larve devono essere ulteriormente studiate o allevate, rimuoverle con cura dall'agarosio utilizzando una pinza fine, quindi trasferirle in terreno E3 senza tricaina per il recupero. Se non devono essere utilizzati ulteriormente, sopprimerli secondo il protocollo animale approvato (l'immersione rapida e prolungata in un bagno di ghiaccio è un metodo comune) e smaltirli come richiesto dall'istituzione.

Figura 1: Ablazione selettiva di cellule interneuromast mediante irradiazione laser. (A) Le cellule interneuromast tra i neuromasti primIL3 e primIL4 sono state selezionate per l'ablazione. Queste cellule mostrano una caratteristica forma a fuso con proiezioni allungate che si sovrappongono ai corpi cellulari adiacenti. (B) L'imaging pre-ablazione ha identificato i corpi cellulari che potrebbero essere ablati per produrre un gap. (C) L'imaging post-ablazione conferma il successo dell'ablazione, come indicato dall'assenza di corpi cellulari nella regione del gap. Barre della scala = 10 μm.

Figura 2: L'imaging post-ablazione dimostra la morte cellulare in risposta all'esposizione al laser in cellule interneuromasti marcate con GFP (Green fluorescent protein). L'imaging con fotomoltiplicatore a luce trasmessa (T-PMT) indica la presenza di una cellula necrotica con un aspetto granulare (cerchiata) e il reclutamento di cellule di forma irregolare che sono probabilmente macrofagi (*). La fusione dei canali GFP e T-PMT conferma che la morte cellulare e l'attività dei macrofagi si sono verificate nel sito di ablazione. Barre di scala = 10 μm.