Monitoraggio del recupero delle cellule interneuromast ablate con laser in zebrafish mediante microscopia confocale

Abstract

Fonte: Volpe, B. A.A., et al. }} Saggio di ablazione e rigenerazione laser basato su microscopio confocale in cellule interneuromast di zebrafish. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020)

Questo video mostra il monitoraggio del recupero interneuromastocitario nel pesce zebra utilizzando la microscopia confocale, monitorando la morte e la riparazione cellulare attraverso l'imaging a fluorescenza time-lapse.

Protocollo

1. Imaging post-ablazione e microscopia time-lapse per studiare la rigenerazione

1. Clicca sul menu a tendina per "Canali". Nei canali, deselezionare la traccia "DAPI"(4′,6-diamidino-2-fenilidolo) per disattivare il laser di ablazione. Fare clic sul menu a discesa per "Modalità di acquisizione".
2. In modalità di acquisizione, fare clic su "Zoom".
3. Riduci lo zoom a 0,7 utilizzando il cursore o digitando "0,7."
   1. Per garantire il successo dell'ablazione cellulare, aumenta il guadagno a 900 e scansiona rapidamente il campo visivo.
      NOTA: Nessuna GFP (proteina fluorescente verde) dovrebbe essere visibile all'interno della cellula o delle cellule bersaglio. Utilizzando le stesse impostazioni o impostazioni simili a quelle descritte per l'imaging pre-ablazione, acquisire e salvare un'immagine post-ablazione (Figura 1C). Se l'immagine rivela resti di cellule fluorescenti o corpi cellulari aggiuntivi che devono essere rimossi, ripetere i passaggi dell'ablazione laser per creare uno spazio visibile nella stringa di cellule interneuromastiche.
   2. Ispezionare l'immagine del canale T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube) per confermare ulteriormente il danno cellulare. Le cellule danneggiate avranno un aspetto granulare e i nuclei si gonfieranno frequentemente o diventeranno di forma irregolare (Figura 2).
4. Dopo aver acquisito un'immagine pre-ablazione, aver ablato le cellule secondo necessità e aver acquisito un'immagine post-ablazione per ogni singola posizione dello stadio, impostare la microscopia time-lapse attivando sia la posizione dello stadio che le opzioni temporali per l'acquisizione dell'immagine. Impostare i parametri temporali su 24 ore o un altro punto finale desiderato e intervalli di 15 minuti. Avviare l'esperimento per acquisire le immagini e salvare il file risultante al termine (il giorno successivo).
5. Se le larve devono essere ulteriormente studiate o allevate, rimuoverle con cura dall'agarosio utilizzando una pinza fine, quindi trasferirle in terreno E3 senza tricaina per il recupero. Se non devono essere utilizzati ulteriormente, sopprimerli secondo il protocollo animale approvato (l'immersione rapida e prolungata in un bagno di ghiaccio è un metodo comune) e smaltirli come richiesto dall'istituzione.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
diapositive stampate PTFE a 12 pozzetti	Scienze di microscopia elettronica	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaina in acqua di osmosi inversa
1X E3 + 600 μM Tricaine			Diluisci 15 mM di stock di Tricaina 25X in supporti 1X E3
1X E3 media	<	Diluire 60X E3 media a 1X in acqua ad osmosi inversa (16.7 ml/L)
60 X E3 media	Tutti i componenti acquistati da Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 litro di acqua ad osmosi inversa
Bx60 Microscopio composto con lampada ad arco di mercurio fluorescente	Olimpo
Microscopio confocale LSM 700 dotato di laser da 405 nm, 488 nm e 555 o 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Per l'ablazione è stato utilizzato un laser da 5 mW 405 nm; Le ablazioni e l'imaging sono state eseguite attraverso un obiettivo Plan-Apochromat 63x con un NA di 1.40
FIJI/ImageJ Software di elaborazione delle immagini	Contributori multipli		Scaricabile a https://fiji.sc/
Ago da dissezione modificato in coltello per capelli	Fisher Scientific	19010	Una ciglia è stata incollata sull'estremità di un ago da dissezione con manico in legno
software Microsoft Excel	Microsoft Corp.		Google sheets è un'alternativa gratuita a Microsoft Excel
Piatti da 35 mm con n. 1.5 vetrino coprioggetti, finestra da 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	Piastra di Petri da 35 mm, finestra di vetro da 20 mm
Immersol 518F Olio da immersione	Fisher Scientific	12-624-66A
Agarosio gelificante basso	Scienze della vita Sigma	A9414-256
Inserto Corning Netwell con rete in poliestere da 74 um, inserto da 24 mm<	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Scaricabile su https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereomicroscopio	Motic
Pipetta di trasferimento	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC

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