Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Abstract

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca²⁺ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)

Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Protocollo

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p style='altezza-linea:1.380000000000000001;margine-inferiore:6pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'>Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dalla revisione etica animale appropriata comitato.

1.Prepara Buffer di Krebs modificato.

Crea un buffer Krebs modificato in modo tale che le concentrazioni finali (in mM) dei componenti siano le seguenti: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 1 acido piruvico e 8 glucosio (pH regolato a 7,4 con NaOH). Aggiungi 3 μM di nicardipina e 1 μM di scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante Ca²⁺ imaging e dissezioni a montaggio intero.

2. Imaging e analisi

NOTA: Usa almeno un impianto di imaging di base con una sorgente di luce fluorescente, un microscopio, una fotocamera CCD di qualità e un software di acquisizione appropriato. Variare l'aggiunta di altri componenti a seconda della sorgente luminosa e dell'applicazione specifica. Una ruota portafiltri e un otturatore devono essere utilizzati con una tradizionale sorgente di luce ad arco allo xeno. Tuttavia, le sorgenti luminose a LED e i sistemi di illuminazione non richiedono tali componenti.

1. Posiziona la camera di registrazione sotto il microscopio e utilizzando un sistema di perfusione a flusso gravitazionale con più serbatoi di siringhe riscaldati stabilisci una velocità di perfusione continua di 2–3 ml/min di tampone Krebs a 37 °C. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle d'aria sia nella linea di ingresso che in quella di aspirazione collegata a un sifone.
2. Mettere a fuoco il plesso desiderato con l'illuminazione a campo chiaro. Evitare di sovraesporre i tessuti, che possono portare al fotosbiancamento.
3. Esaminare il carico di Fluo-4 all'interno dei gangli e selezionare i gangli sani per l'imaging. I gangli malsani/danneggiati mostreranno una morfologia autofluorescente o puntata e non dovrebbero essere utilizzati per l'imaging.
4. Una volta selezionato il ganglio, deviare il percorso della luce verso la telecamera e ottenere un'immagine dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che il ganglio sia a fuoco e impostare la velocità di acquisizione dell'immagine e i tempi di esposizione.
   NOTA: Le velocità e i tempi di acquisizione delle immagini variano a seconda degli eventi che gli investigatori desiderano registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immagini vengono tradizionalmente acquisite a 0,5-1 Hz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hz per i neuroni perché glial Ca²⁺ risposte non sono rapide come Ca²⁺ transienti nei neuroni.
5. Iniziare l'esperimento e stabilire l'attività di base per 30 secondi.
6. Applicare farmaci preriscaldati di interesse, come agonisti e antagonisti recettoriali, utilizzando il sistema di perfusione a flusso gravitazionale a una velocità di 2-3 ml/min. Seguire l'applicazione di agonisti/antagonisti tornando ad una perfusione del normale tampone e lasciare un periodo di lavaggio/recupero di almeno 10 minuti.
   NOTA: I tempi di applicazione del farmaco variano a seconda del singolo composto e del disegno sperimentale. In generale, un'applicazione di 20-30 secondi di agonista è sufficiente per attivare i recettori accoppiati a proteine G nei neuroni e nelle cellule gliali. Tuttavia, i canali ionici ligando-dipendenti (come i recettori nicotinici dell'acetilcolina) richiedono tempi di applicazione non superiori a 5-10 secondi. Ulteriori esposizioni di durata causeranno una rapida desensibilizzazione dei canali ionici ligando-dipendenti. Gli antagonisti devono essere applicati per circa 3-15 minuti per garantire il blocco completo delle vie recettoriali. Tuttavia, questa è una generalizzazione grossolana e i ricercatori dovrebbero sempre ottimizzare qualsiasi farmaco sperimentale nel loro particolare paradigma.
7. Interrompi la registrazione e visualizza il filmato time-lapse dell'esperimento. Seleziona attentamente le regioni di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi delle immagini appropriato.
8. Utilizzare il software per normalizzare e confrontare l'intensità della fluorescenza ROI con il valore di fluorescenza di base iniziale. Le modifiche alla fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle modifiche in [Ca²⁺].
   1. Usa una modifica di un metodo descritto in precedenza utilizzando ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)sfondo, dove F1 è la fluorescenza in un dato punto e F0 è la fluorescenza di base, per migliorare l'accuratezza della valutazione. Questa modifica aiuta a ridurre il rumore dovuto ai cambiamenti di fluorescenza nei preparati tissutali che mostrano il movimento dello strato muscolare sottostante il plesso mioenterico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucosio	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Strumenti scientifici	Minutien Pins
Software di imaging di cellule vive iQ	Andor	Andor iQ3
Cloruro di potassio	Sigma	P3911
Cloruro di magnesio	Sigma	M9272
Cloruro di sodio	Sigma	S9888
Sodio diidrogeno fosfato	Sigma	S8282
Bicarbonato di sodio	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Pompa peristaltica	Harvard Apparatus	Modello 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecolare Sonde<
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning<
Regolatore di temperatura	Warner Instruments	TC-344C

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