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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Riempimento degli astrociti con ionoforesi
- Test dell'elettrodo.
- Metti delicatamente una fetta di cervello in un piatto con fondo di vetro riempito con 0,1 M di PBS a temperatura ambiente. Tenere la fetta in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon.
- Assicurarsi che l'elettrodo sia collegato a una fonte di tensione e posizionare l'elettrodo di terra nella vasca contenente la fetta di cervello.
- Sposta l'obiettivo nella regione del cervello di interesse.
- Abbassare l'elettrodo nella soluzione. Sotto il campo luminoso, spostalo al centro del campo visivo ed esaminalo attentamente con la lente a immersione in acqua 40x per assicurarti che appaia chiaro e senza detriti o bolle. Se c'è qualcosa che ostruisce la punta dell'elettrodo, sostituirla con una nuova.
NOTA: L'intasamento è un problema per l'elettrodo da 200 MΩ. Con la centrifugazione e la filtrazione della soluzione colorante prima di ogni esperimento, questo non dovrebbe essere un problema frequente. Tuttavia, poiché la punta dell'elettrodo è piccola, a volte il tessuto può rimanere bloccato nell'apertura. Gli autori non hanno trovato un modo per prevenirlo, ma può essere facilmente affrontato semplicemente utilizzando un nuovo elettrodo. - Sotto il campo chiaro, abbassare lentamente l'elettrodo verso la fetta fermandosi appena sopra la superficie.
- Riempire gli astrociti con ionoforesi.
- Identificare gli astrociti a 40-50 μm sotto la superficie della fetta con il contrasto di interferenza differenziale a infrarossi (IR-DIC). Cerca cellule con somata allungati di forma ovale di circa 10 μm di diametro. Una volta scelto un astrocita, spostalo al centro del campo visivo.
NOTA: Una buona cella per la ionoforesi ha bordi chiari e definiti intorno ad essa. Non scegliere celle troppo vicine alla superficie della fetta perché non possono essere riempite completamente. Ci vuole un po' di pratica nell'arco di alcuni giorni per essere in grado di identificare regolarmente gli astrociti per il riempimento del colorante. A seconda dell'area cerebrale utilizzata per l'esperimento, il numero di astrociti può variare. Ciò può influire sul tempo necessario per identificare un astrocita prima del riempimento. - Abbassare lentamente la punta dell'elettrodo nella fetta, navigando attraverso il tessuto, fino a quando non si trova sullo stesso piano del corpo cellulare.
NOTA: Muovi l'elettrodo lentamente per evitare di danneggiare il tessuto. - Una volta che il corpo cellulare dell'astrocita è chiaramente visibile e delineato, far avanzare lentamente e delicatamente l'elettrodo in avanti. Muovere l'elettrodo fino a quando la punta non impala il soma della cella. Spostare lentamente la messa a fuoco dell'obiettivo su e giù per notare se l'elettrodo si trova all'interno del soma.
NOTA: La punta dell'elettrodo deve essere all'interno del corpo cellulare e deve essere osservata una piccola rientranza sul soma. Non spostare ulteriormente l'elettrodo per evitare che la punta attraversi la cella. - Una volta che la punta dell'elettrodo è all'interno della cella, accendere lo stimolatore a ~0,5-1 V ed espellere continuamente la corrente nella cella. Usando il microscopio confocale, osserva il riempimento cellulare. Aumentare lo zoom digitale per vedere i dettagli della cella e assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia visibile all'interno della cella.
NOTA: Abbassa la tensione se sembra che il colorante fuoriesca dalla cella o riempia altre celle nelle vicinanze. Se sembra che il colorante continui a fuoriuscire dalla cella, estrarre lentamente l'elettrodo e trovare un'altra cella. È importante che il colorante non perda per avere un elevato rapporto segnale/sfondo nell'immagine finale. - Attendere circa 15 minuti fino a quando i rami e i processi più fini appaiono definiti, spegnere la tensione ed estrarre delicatamente la punta dell'elettrodo dalla cella.
- Immagina la cella piena.
NOTA: L'imaging può essere eseguito immediatamente dopo il riempimento. Un obiettivo con un'apertura numerica (NA) più elevata si traduce in una migliore risoluzione. - Attendere che la cellula ritorni alla sua forma originale prima di eseguire l'imaging (15-20 min) con l'obiettivo 40x. Per visualizzare la cellula, regolare l'impostazione sul confocale per assicurarsi che i rami e i processi più fini appaiano definiti.
- Imposta uno z-stack con una dimensione del passo di 0,3 μm. Durante l'imaging, spostare l'obiettivo fino a quando non c'è segnale dalla cella e impostarlo come parte superiore. Quindi, sposta l'obiettivo verso il basso (mettendo a fuoco attraverso la cella) fino a quando non c'è segnale, impostalo come parte inferiore.