Incorporamento del cervello di Drosophila in una matrice per l'imaging time-lapse dei neuroni dell'orologio circadiano

Abstract

Fonte: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Imaging in tempo reale a fluorescenza con risoluzione a cellula singola di �Orologi circadiani nel cervello larvale Cultura. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la procedura per incorporare il cervello Drosophila in una matrice di fibrina, seguita da imaging a fluorescenza time-lapse di neuroni dell'orologio circadiano per analizzare l'attività ritmica sincronizzata con i cicli luce/buio.

Protocollo

1. Incorporazione di espianti cerebrali in una matrice 3D e montaggio (~20 min).
   1. Immergere un cervello sezionato in una soluzione di lavoro di fibrinogeno (concentrazione finale di fibrinogeno ~3,3 mg/mL, 10,5 μL per cervello) come segue:
   2. Aspirare 3,5 μL di terreno attivo schneider (SAM)/antibiotici. Aspirare un cervello sezionato dal pozzetto di dissezione nello stesso puntale della pipetta senza erogare il mezzo SAM/antibiotici nel puntale.
   3. Erogare il cervello e il medium sul coperchio di una capsula di Petri sterile. Aggiungere altri 3,5 μL di SAM/antibiotici e 3,5 μL di soluzione calda di fibrinogeno/SAM 10 mg/mL alla goccia contenente il cervello. Miscelare delicatamente la soluzione intorno al cervello pipettandola con un puntale per pipetta da 20 μl.
      NOTA: L'uso di una pipetta piuttosto che di una pinza in questo passaggio evita di stressare il cervello.
   4. Prelevare 2 μl della soluzione di lavoro del fibrinogeno dalla goccia e applicarla in un piccolo cerchio sul vetrino coprioggetti del piatto con fondo di vetro. Aggiungere 0,8 μl di trombina e mescolare molto rapidamente con il puntale di una pipetta. Il fibrinogeno viene convertito in fibrina e inizia a polimerizzare.
   5. Prendi il cervello che si trova nella soluzione funzionante del fibrinogeno (passo 1.1) tra un paio di pinze e posizionalo sulla matrice una volta che una matrice bianca di fibrina è visibile. Orientare il cervello con il lato anteriore rivolto verso il basso (per l'imaging dei neuroni dell'orologio). Spingerlo verso il basso il più vicino possibile al vetro di copertura. Il coagulo di fibrina è composto da strati di fibrina. Raccogli uno strato e piegalo sopra il cervello con movimenti piccoli e delicati senza staccare la matrice.
      1. Ripeti 2 o 3 volte da diverse parti del coagulo per stabilizzare il cervello.
         NOTA: Quando si maneggia il cervello con il forcipe, fare attenzione a non seccarlo o a non sottoporlo a stress fisico.
   6. Aggiungere 20 μl di SAM/antibiotici sopra il cervello incorporato per fermare l'azione della trombina.
   7. Ripetere la procedura per montare i cervelli rimanenti. Fino a cinque o sei cervelli possono essere incorporati in un piatto con fondo di vetro.
   8. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, aggiungere 600 μl di SAM/antibiotici nel pozzetto interno (la parte in vetro). Posizionare una membrana pretagliata in politetrafluoroetilene (PTFE) sopra il fluido e attaccarla al grasso sottovuoto applicato sulla parte plastica del fondo (Figura 1A).

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti KH2PO4Sigma-AldrichP5655Non sono sicuro che siano esattamente gli stessi che abbiamo in laboratorio. Ho scelto "adatto per la coltura di cellule di insetti" ogni volta che disponibileCaCl2Sigma-AldrichC7902 MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391 NaClSigma-AldrichS5886 NaHCO3Sigma-AldrichS5761 D-(+) Glucosio style='colore-sfondo:#ffffff;colore:#1a202c;famiglia-carattere:Roboto;dimensione-carattere:12pt;peso-carattere:normale;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;spazio-bianco:normale;involucro-parola:parola-interruzione;strategia-avvolgere:4;'>Sigma-AldrichG7021 Estratto di lievitoSigma-AldrichY1000 InsulinaSigma-AldrichI0516-5ML Penicillina-StreptomicinaSigma-AldrichP4333 BIS-TRISSigma-AldrichB4429 L-(−)-Acido malicoSigma-AldrichM7397 D-(+)-Trealosio diidratoSigma-AldrichT0167 Acido succinicoSigma-AldrichS9512 Acido fumaricoSigma-AldrichF8509 α-acido chetoglutaricoSigma-AldrichK1128 Non inattivato dal calore, micoplasma e virus del siero di vitello fetale (FCS)BioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I HEPES-KOH, pH 7.4E&K Prodotti ScientificiEK-654011 KClSigma-AldrichP5405 NaH2PO4Sigma-AldrichS5011 <tr style='altezza:21px;' >Saccarosio style='colore-sfondo:#ffffff;colore:#1a202c;famiglia-carattere:Roboto;dimensione-carattere:12pt;peso-carattere:normale;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;spazio-bianco:normale;word-wrap:parola-interruzione;strategia-avvolgente:4;'>Sigma-AldrichS7903 Fibrinogeno da plasma bovinoCalbiochem (Merck)341573-1GMATTENZIONE: Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Manipola sotto il flusso laminareThrombin from bovine plasmaSigma-AldrichT9549ATTENZIONE: Pericolo per la salute, usa i guantiPDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH<td style='colore di sfondo:#ffffff; colore:#1a202c; famiglia di caratteri:Roboto; dimensione del carattere: 12pt; peso del carattere:normale; trabocco:nascosto; imbottitura:0px 3px; allineamento verticale:in basso; spazio-bianco:normale; ritorno a capo: spezzare la parola; strategia-avvolgere:4;' >Chi Scientificcustom made Grasso sottovuotoSigma-Aldrich18405 35 mm Piatto, n. 1.5 Vetrino coprioggetti, 20 mm Diametro vetro, Non rivestitoMatTekP35G-1.5-20-C Piatti per coltura tissutale Corning Falcon Easy-GripFisherscientific08-772A Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm filettato per flacone top filtro, 0.22 μmMilliporeSCGPS05RE Pellicola in politetrafluoroetilene (PTFE)Dupont200A Teflon FEP Film Millex-HV Unità filtro siringa, 0.45 μm, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gammaMilliporeSLHV033RS Millex-GV Unità di Filtro per Siringa, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggiMilliporeSLGV033RS Piatto di dissezione in vetro a tre pozzettiQualsiasi azienda Pinze fini, misura 5, DumontStrumenti di Fine Science11254-20 Scanner tandem microscopio confocale TCS SP5 invertito, con scanner risonante e rivelatori fotomoltiplicatori HyDLeica microsystem CMS GmbH Camera di controllo della temperaturaLife Imaging ServicesIl sistema di controllo della temperatura CUBE & BOX, progettato su misura Stage-top humidity controllerServizi di imaging della vitapersonalizzato Micro Dispenser ad Immersione in Acqua: erogatore, micro-pompa estesa serie MP6 e software Autoimmersion Objective ControllerLeica microsystem CMS GmbH Plugin per la creazione di stack SUM e la deriva della correzione 3Dsoftware ImageJ 10x deconvoluzione iterativaSoftware AutoQuant e Imaris