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1. Placcatura delle cellule
NOTA: Sulla base dell'esperienza, vengono raccolte circa 100.000 cellule vitali per embrione. Topi gravidi di 2-3 mesi hanno tipicamente una cucciolata di 8-10 embrioni; quindi, una stima approssimativa per la resa totale di cellule per topo gravido temporizzato è di circa 1 milione di cellule.
- Utilizzando un emocitometro, esegui un conteggio delle cellule e poi diluisci la sospensione a 2.000 cellule/μL utilizzando un terreno di coltura cellulare. Triturare brevemente per mescolare.
- Rimuovere i vetrini coprioggetti con soluzione di laminina dall'incubatrice e aspirare la soluzione di laminina rimanente dai vetrini coprioggetti rivestiti utilizzando un aspirapolvere. Placcare rapidamente per evitare che i vetrini si asciughino completamente. Pipettare 100 μl (2,0 x 105 cellule/vetrino coprioggetti) su ciascun vetrino coprioggetti e posizionare le piastre di Petri in un incubatore a 37 °C per 1 ora.
- Aggiungi attentamente 3 ml di terreno di coltura cellulare a ogni piatto e rimettilo nell'incubatore a 37 °C. Preformare mezzi cambi 2 volte a settimana per 2 settimane.
2. Infezione della coltura cellulare a 14 (giorni in vitro) DIV con vettori
- virali adeno-associati (AAV)Per ogni piatto preparare 1 ml di terreno DMEM privo di siero con 1 μL di hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titolo)
- Aspirare il terreno di coltura cellulare da ciascuna piastra e sostituirlo con 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) privo di siero contenente hSyn-GCaMP6f. Rimettere le piastre nell'incubatore a 37 °C per 1 ora.
- Aspira il terreno libero dal siero contenente AAV e sostituiscilo con 3 ml di terreno di coltura cellulare. Riposizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C. Abbiamo scoperto che 5-7 giorni di infezione da AAV consentono livelli ideali di espressione di GCaMP. Continuare a cambiare il terreno ogni 2-3 giorni durante questo periodo di infezione virale.
3. Imaging confocale Ca2+ dal vivo tra 19-21 giorni in vitro (DIV)
NOTA: L'imaging può essere eseguito tra 5-7 giorni dopo l'infezione virale. Questa è la finestra ideale per ottenere l'espressione visibile del fluoroforo a livelli che consentono di rilevare l'attività spontanea del Ca2+.
- Preparazione dei buffer di registrazione
- Per fare 1 L di buffer di registrazione HEPES, aggiungi: 9,009 g di NaCl, 0,3728 g di KCl, 0,901 g di D-glucosio, 2,381 g di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosulfonico (HEPES), 2 mL di soluzione madre 1 M CaCl2 e 500 μL di soluzione madre 1 M MgCl2 a 800 ml di H2 distillato sterileO. Portare il pH a 7,4 con NaOH. Portare ad un volume finale di 1 L.
- Per fare 200 mL di tampone di registrazione del glutammato 20 μM, diluisci 40 μL di soluzione madre di glutammato 100 mM in 200 mL di tampone di registrazione HEPES descritto sopra.
- Imaging
- confocaleRiempi una capsula di Petri sterile da 35 mm con 3 mL di buffer di registrazione.
- Rimuovi una capsula di Petri da 35 mm con colture infette dall'incubatrice a 37 °C. Utilizzando una pinza a punta fine, afferrare con cautela il bordo di un vetrino coprioggetti e trasferirlo rapidamente nella piastra di Petri riempita con il buffer di registrazione. Riposizionare il vetrino coprioggetti rimanente nel terreno nell'incubatore a 37 °C. Trasportare la capsula con il tampone di registrazione al microscopio confocale.
- Avvia il software di imaging. Procedi al passaggio successivo durante l'inizializzazione.
- Avvia la pompa peristaltica e posiziona la linea nel buffer di registrazione. Calibrare la velocità del flusso in modo che sia di 2 ml/min.
- Trasferisci il vetrino coprioggetti infetto dalla capsula di Petri da 35 mm nel bagno di registrazione.
- Utilizzando l'obiettivo a immersione in acqua 10x e la luce a campo chiaro (BF), trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 40x e usa la luce BF per rimettere a fuoco il campione.
- Nella finestra "Lista coloranti" all'interno di FluoView, seleziona AlexaFluor 488 e applicalo.
- Le espressioni AAV possono essere variabili; quindi, per prevenire la sovraesposizione e il fotobleaching dei fluorofori, inizia con impostazioni di bassa HV e potenza laser. Per il canale AlexaFluor 488, impostare l'alta tensione (HV) su 500, il guadagno su 1x e l'offset su 0. Per la linea laser 488 impostare la potenza al 5%. Per aumentare il volume effettivo ripreso nel piano z, aumentare la dimensione del foro stenopeico a 300 μm. Utilizzare l'opzione di scansione "focus x2" per regolare in modo ottimale i segnali di emissione a livelli inferiori alla saturazione. Da qui, le impostazioni possono essere regolate fino a raggiungere la visibilità ideale di ciascun canale.
NOTA: Per catturare con precisione l'intera gamma di flussi di Ca2+ con GCaMP, regola le impostazioni di base HV e di potenza del laser per consentire un aumento dell'intensità fluorescente senza saturare eccessivamente il rivelatore. - Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, sposta il tavolino per localizzare una regione con più celle che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e metti a fuoco sul piano desiderato per l'imaging.
- Usa lo strumento "Clip rect" per ritagliare il fotogramma dell'immagine a una dimensione che può raggiungere un intervallo di fotogrammi di poco meno di 1 secondo. Ciò è necessario per impostare l'intervallo di imaging a 1 fotogramma al secondo.
- Imposta la finestra "Intervallo" su un valore di 1.0 e la finestra "Num" su 600.
NOTA: Per fornire diversi buffer di registrazione al punto temporale desiderato (300 s), è importante calibrare la latenza della pompa per fornire la nuova soluzione al bagno. Ciò dipenderà dalla velocità di perfusione della soluzione (2 mL/min) e dalla lunghezza della linea utilizzata per pompare la soluzione. - Per catturare un filmato della serie t, seleziona l'opzione "Tempo" e poi usa l'opzione di scansione "XYt" per iniziare l'imaging.
- Guarda la barra di avanzamento dell'imaging e sposta la linea dal buffer di registrazione HEPES al buffer di registrazione del glutammato da 20 μM al momento appropriato (ad esempio, se la latenza della pompa è calibrata per erogare la soluzione a 60 s, sposta la linea nel tampone glutammato a 240 fotogrammi per erogare glutammato a 300 s).
- Quando l'imaging è completo, seleziona il pulsante Series Done e salva il filmato della serie t finito. Continuare a perfondere 20 μM di glutammato per altri 5 minuti, in modo che i neuroni coltivati siano stati esposti al glutammato per un totale di 10 minuti. Ripetere questa procedura per ogni vetrino coprioggetti da riprodurre.
- Dopo l'ulteriore esposizione di 5 minuti a 20 μM di Glutammato, rimuovi il vetrino coprioggetti dal bagno e rimettilo nella capsula di Petri da 35 mm contenente il buffer di registrazione fino al completamento del giorno dell'imaging.