Imaging delle placche di beta-amiloide in sezioni di tessuto cerebrale mediante immunomarcatura e colorazione con curcumina

Abstract

Fonte: Maiti, P. et. al.,. {{}}{{}}J. vis. Exp.{{}}{{}} (2019)

Questo video mostra la procedura di imaging delle placche di beta-amiloide in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'immunomarcatura e la colorazione con curcumina. L'immunomarcatura fornisce la specificità per l'amiloide-beta, mentre la curcumina lega selettivamente le fibrille ricche di fogli β, migliorando la visualizzazione. La co-localizzazione della fluorescenza rossa e verde conferma la presenza di placche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

{{TAG_ 16}}1. Perfusione degli animali

1. Preparare i tamponi fissativi e di perfusione.
   1. Preparare un tampone fosfato di sodio 0,1 M aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 21,7 g di idrogeno fosfato disodico (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄) e acqua distillata doppia per un totale di 1 L.
   2. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA).
      1. Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Riscaldare la soluzione di PFA a 60-65 °C e mescolare utilizzando un agitatore magnetico.
         NOTA: La temperatura non deve superare i 65 °C.
      3. Aggiungere alcune gocce di idrossido di sodio (NaOH) (1 N) con un contagocce per sciogliere completamente il PFA.
      4. Filtrare la soluzione di PFA con carta da filtro da media a fine e conservare a 4 °C.
         NOTA: La soluzione è valida per un mese.
2. Eseguire l'anestesia e la perfusione animale.
   NOTA: APP B6SJL-Tg di dodici mesi SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x malattia di Alzheimer familiare (5×FAD)) topi di controllo di pari età (n = 6 per gruppo) sono stati acquistati dai venditori e allevati nella casa degli animali della Saginaw Valley State University. La genotipizzazione è stata confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR). Il tessuto cerebrale umano Alzheimer's disease (AD) include il tessuto cerebrale AD post-mortem e il tessuto di controllo di pari età.
   1. Anestetizzare l'animale con un agente anestetico appropriato, come il pentobarbital sodico (390 mg/kg di peso corporeo) o una miscela di ketamina/xilazina (fino a 80 mg/kg di ketamina di peso corporeo e 10 mg/kg di xilazina di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale (ago da 27 G e siringa da 1 mL). Controllare il livello di anestesia pizzicando un dito del piede. Se l'animale non risponde, è pronto per la chirurgia di perfusione.
   2. Posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina sul vassoio per la chirurgia di perfusione e, utilizzando piccole forbici per l'iride, praticare un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro.
   3. Inserire un ago da perfusione da 22 G nel ventricolo sinistro e praticare una piccola incisione sul padiglione auricolare destro per rimuovere il liquido di perfusione dal corpo. Utilizzare un sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire al fluido di perfusione ghiacciato (0,1 M PBS, pH 7,4) di fluire per 5-6 minuti (portata 20-25 ml/min).
      NOTA: Un fegato pulito è l'indicatore di una perfusione ottimale.
   4. Passare la valvola tampone a una soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% per il fissaggio e lasciarla fluire per 8-10 minuti.
      NOTA: Il tremore seguito da arti induriti o rigidi è un indicatore di buona fissazione.
   5. Rimuovi il cervello dal cranio usando le forbici. Usando una spatola, raccogliere il cervello e metterlo in una fiala di PFA al 4% (almeno 10 volte il volume del cervello) e conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo.

2. Processamento dei tessuti

1. Tagliare le sezioni del criostato.
   1. Trasferire il cervello in soluzioni di saccarosio graduate (10%, 20% e 30%) e conservare a 4 °C per 24 ore ciascuna, fino all'uso.
   2. Utilizzando un criostato a -22 °C, tagliare sezioni spesse 40 μm. Raccogliere 10-20 sezioni per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti riempita con PBS e sodio azide (0,02%).

3. Colocalizzare cur(curcumina) con l'anticorpo Aβ nelle placche e negli oligomeri Aβ.

1. Lavare le sezioni del criostato dal passaggio 2.1.2 con PBS 3x in una piastra a 12 pozzetti.
2. Bloccare le sezioni con il 10% di siero normale di capra (NGS) disciolto in PBS con lo 0,5% di Triton-X-100 a temperatura ambiente per 1 ora.
3. Scartare la soluzione bloccante. Incubare le sezioni con anticorpi specifici per l'amiloide-beta (Aβ) (6E10 o A11, diluiti 1:200) disciolti in una soluzione bloccante fresca contenente il 10% di NGS e lo 0,5% di Triton-X100 per una notte a 4 °C in un agitatore a 150 giri/min.
4. Scartare la soluzione anticorpale e lavare le sezioni con PBS 3 volte per 10 minuti ciascuna.
5. Incubare con l'etichetta dell'anticorpo secondario con fluoroforo rosso (ad es. Alexa
6. 594) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare con PBS 3 volte per 10 minuti ciascuno.
8. Lavare con alcool al 70% 1x.
9. Incubare le sezioni con curcumina (Cur (10 μM)) per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Lavare con alcool al 70% 3 volte per 1 minuto ciascuno.
11. Disidratare con alcol al 90% e al 100% per 1 minuto ciascuno, chiarificare con xilene 2 volte per 5 minuti ciascuno e montare sui vetrini utilizzando } plastificante stirene xilene (DPX).
12. Visualizzazione utilizzando un microscopio a fluorescenza con filtri di eccitazione/emissione appropriati per i segnali rosso e verde.

Materiali