Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
{{TAG_ 16}}1. Perfusione degli animali
- Preparare i tamponi fissativi e di perfusione.
- Preparare un tampone fosfato di sodio 0,1 M aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 21,7 g di idrogeno fosfato disodico (Na2HPO4·7H2O), 2,59 g di fosfato monobasico di potassio (KH2PO4) e acqua distillata doppia per un totale di 1 L.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA).
- Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
- Riscaldare la soluzione di PFA a 60-65 °C e mescolare utilizzando un agitatore magnetico.
NOTA: La temperatura non deve superare i 65 °C. - Aggiungere alcune gocce di idrossido di sodio (NaOH) (1 N) con un contagocce per sciogliere completamente il PFA.
- Filtrare la soluzione di PFA con carta da filtro da media a fine e conservare a 4 °C.
NOTA: La soluzione è valida per un mese.
- Eseguire l'anestesia e la perfusione animale.
NOTA: APP B6SJL-Tg di dodici mesi SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x malattia di Alzheimer familiare (5×FAD)) topi di controllo di pari età (n = 6 per gruppo) sono stati acquistati dai venditori e allevati nella casa degli animali della Saginaw Valley State University. La genotipizzazione è stata confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR). Il tessuto cerebrale umano Alzheimer's disease (AD) include il tessuto cerebrale AD post-mortem e il tessuto di controllo di pari età. - Anestetizzare l'animale con un agente anestetico appropriato, come il pentobarbital sodico (390 mg/kg di peso corporeo) o una miscela di ketamina/xilazina (fino a 80 mg/kg di ketamina di peso corporeo e 10 mg/kg di xilazina di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale (ago da 27 G e siringa da 1 mL). Controllare il livello di anestesia pizzicando un dito del piede. Se l'animale non risponde, è pronto per la chirurgia di perfusione.
- Posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina sul vassoio per la chirurgia di perfusione e, utilizzando piccole forbici per l'iride, praticare un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro.
- Inserire un ago da perfusione da 22 G nel ventricolo sinistro e praticare una piccola incisione sul padiglione auricolare destro per rimuovere il liquido di perfusione dal corpo. Utilizzare un sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire al fluido di perfusione ghiacciato (0,1 M PBS, pH 7,4) di fluire per 5-6 minuti (portata 20-25 ml/min).
NOTA: Un fegato pulito è l'indicatore di una perfusione ottimale. - Passare la valvola tampone a una soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% per il fissaggio e lasciarla fluire per 8-10 minuti.
NOTA: Il tremore seguito da arti induriti o rigidi è un indicatore di buona fissazione. - Rimuovi il cervello dal cranio usando le forbici. Usando una spatola, raccogliere il cervello e metterlo in una fiala di PFA al 4% (almeno 10 volte il volume del cervello) e conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
2. Processamento dei tessuti
- Tagliare le sezioni del criostato.
- Trasferire il cervello in soluzioni di saccarosio graduate (10%, 20% e 30%) e conservare a 4 °C per 24 ore ciascuna, fino all'uso.
- Utilizzando un criostato a -22 °C, tagliare sezioni spesse 40 μm. Raccogliere 10-20 sezioni per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti riempita con PBS e sodio azide (0,02%).
3. Colocalizzare cur(curcumina) con l'anticorpo Aβ nelle placche e negli oligomeri Aβ.
- Lavare le sezioni del criostato dal passaggio 2.1.2 con PBS 3x in una piastra a 12 pozzetti.
- Bloccare le sezioni con il 10% di siero normale di capra (NGS) disciolto in PBS con lo 0,5% di Triton-X-100 a temperatura ambiente per 1 ora.
- Scartare la soluzione bloccante. Incubare le sezioni con anticorpi specifici per l'amiloide-beta (Aβ) (6E10 o A11, diluiti 1:200) disciolti in una soluzione bloccante fresca contenente il 10% di NGS e lo 0,5% di Triton-X100 per una notte a 4 °C in un agitatore a 150 giri/min.
- Scartare la soluzione anticorpale e lavare le sezioni con PBS 3 volte per 10 minuti ciascuna.
- Incubare con l'etichetta dell'anticorpo secondario con fluoroforo rosso (ad es. Alexa
- 594) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Lavare con PBS 3 volte per 10 minuti ciascuno.
- Lavare con alcool al 70% 1x.
- Incubare le sezioni con curcumina (Cur (10 μM)) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare con alcool al 70% 3 volte per 1 minuto ciascuno.
- Disidratare con alcol al 90% e al 100% per 1 minuto ciascuno, chiarificare con xilene 2 volte per 5 minuti ciascuno e montare sui vetrini utilizzando } plastificante stirene xilene (DPX).
- Visualizzazione utilizzando un microscopio a fluorescenza con filtri di eccitazione/emissione appropriati per i segnali rosso e verde.
