Visualizzazione dell'attività della proteina chinasi A in un topo utilizzando la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni

Abstract

Fonte: Jongbloets, B. C., et al. Visualizzazione dell'attività della proteina chinasi A nei topi che si comportano con la testa fissata utilizzando la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni in vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra una procedura di microscopia di imaging a fluorescenza a due fotoni per visualizzare l'attività della proteina chinasi A in topi con testa fissa durante la locomozione forzata.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. In Vivo Microscopia per imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni

1. Inizia l'imaging con imaging a fluorescenza a due fotoni (2pFLIM) a o oltre 2 settimane dopo l'installazione della finestra cranica. Ridurre al minimo l'interferenza sperimentale dovuta allo stress dovuto alla manipolazione frequente e alla collottola del mouse prima dell'inizio dello studio di imaging per abituare il topo.
2. Impostare la lunghezza d'onda del laser di eccitazione a due fotoni su 960 nm utilizzando il software che controlla il laser a due fotoni.
3. Anestetizzare il topo con isoflurano al 4%. Confermare la corretta anestesia pizzicando la coda e osservando la frequenza respiratoria. Cioè, non dovrebbe esserci alcuna risposta al pizzicamento della coda e la frequenza respiratoria dovrebbe essere ridotta a ~1 respiro al secondo. Per ridurre al minimo i tempi procedurali non necessari e poiché l'anestesia dura solo due o tre minuti, non vengono utilizzati lubrificanti per gli occhi.
4. Trasferire il mouse anestetizzato sul tapis roulant motorizzato (Figura 1C) e montare la piastra del mouse sul supporto della piastra della configurazione del tapis roulant (vedere Figura 1 per i dettagli). Pulire la superficie del vetrino della finestra cranica del mouse con etanolo al 70%.
5. Posizionare il tapis roulant motorizzato con il mouse montato sotto l'obiettivo 2pFLIM. Applicare una goccia di acqua distillata tra il vetrino coprivetro della finestra cranica e l'obiettivo.
6. Lascia che il topo montato si svegli dall'anestesia e si acclimati all'ambiente del tapis roulant e del microscopio per almeno 10 minuti. Monitorare la frequenza respiratoria del topo mentre il topo montato si sveglia dall'anestesia.
7. Navigare verso il punto di iniezione in epi-illuminazione. Documentare le caratteristiche fiduciali (ad esempio, i vasi sanguigni) in campo chiaro per facilitare l'imaging della stessa regione di interesse (ROI) durante le successive sessioni di imaging.
8. Elimina qualsiasi luce in entrata diversa dalla luce emessa dal tessuto cerebrale. Spegnere la sorgente luminosa epi-illumination e chiudere l'involucro del rig 2pFLIM. Attivare il PMT 2pFLIM attivando il comando hardware voltage control.
9. Acquisire un'immagine z-stack 2pFLIM utilizzando il software di acquisizione 2pFLIM FLIMimage con le seguenti impostazioni consigliate per l'imaging di somata tAKARα-positivi in topi svegli. Imposta la media dei fotogrammi su 3 fotogrammi, la velocità di scansione su 2 ms/linea, le dimensioni dell'immagine su 128 x 128 pixel e il campo visivo su 90-100 μm. Regolare le impostazioni di imaging in base alla preparazione e alla configurazione hardware.
10. Ispeziona l'immagine acquisita in FLIM view (software personalizzato sviluppato internamente). Regolare le impostazioni di imaging seguendo il passaggio 1.9 per ottimizzare il conteggio dei fotoni e ridurre al minimo il fotosbiancamento.

NOTA: Un conteggio di fotoni integrato funzionante in un ROI per l'imaging del tempo di vita di un soma tAKARα-positivo in vivo è ~1.000-10.000 fotoni a seconda dell'ampiezza del segnale che risulta da un particolare stimolo.

1. Utilizza un campo visivo ridotto, una velocità di scansione ridotta, una maggiore potenza del laser e un numero maggiore di fotogrammi da calcolare per aumentare il numero di fotoni integrati e ridurre l'errore di stima della durata. Allo stesso tempo, assicurati di utilizzare la potenza laser minima essenziale, la media dei fotogrammi e la velocità di scansione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
2. Acquisire immagini a intervalli di tempo regolari (ad esempio, ogni 30-60 s) ripetendo l'acquisizione z-stack utilizzando le impostazioni determinate al punto 1.10. Acquisire immagini 2pFLIM di base per almeno 15 minuti a velocità zero sul tapis roulant.
3. Impostare la velocità di rotazione del tapis roulant su ~15 cm/s per 15 minuti durante l'acquisizione di immagini 2pFLIM. Continuare l'imaging per ≥20 minuti dopo aver spento la rotazione del tapis roulant, per valutare la durata dell'attività PKA dopo l'interruzione della locomozione forzata.
   

2. Analisi delle immagini 2pFLIM

1. Aprire le immagini acquisite in FLIMview e impostare i seguenti parametri in FLIMview.

1. Fare clic sui campi dell'intervallo minimo e massimo di conteggio dei singoli fotoni (SPC) in FLIMview. Immettere il valore dell'intervallo SPC minimo e massimo appropriato, in genere compreso tra 1,2-2 e 10-12 ns, rispettivamente.

2. Fare clic sul campo del valore t₀ in FLIMview e immettere il valore t₀ (tipicamente ~2 ns). Fare clic sul campo del valore di soglia minimo della luminanza di durata in FLIMview e inserire il valore di soglia desiderato a 5-30 fotoni.

2. Fai clic sul pulsante del nuovo gruppo (N) e assegna un nome al gruppo dell'esperimento. In questo modo verrà generato un gruppo che combina i dati di ogni immagine FLIM aggiunta.

3. Fai clic sul pulsante ROI nel Roi Controls modulo e disegna un ROI attorno a un soma tAKARα-positivo. Riduci l'intervallo z-stack, spostando il limite z inferiore e superiore nei cursori z-stack Control in FLIMview, per ridurre al minimo la contaminazione del segnale proveniente dai fotoni di fondo in altre profondità z.

4. Fare clic sul pulsante + per aggiungere l'immagine FLIM al gruppo (passaggio 2.2). Fare clic sul pulsante Calc per calcolare la durata media (LT, chiamata anche tempo medio di emissione dei fotoni [MPET]), per il ROI e l'errore di stima della durata (δτ).

5. Aprire il file successivo nella serie cronologica di immagini 2pFLIM. Ripetere il passaggio 2.4. Assicurati di regolare la posizione del ROI e dell'intervallo z-stack per misurare lo stesso soma tAKARα-positivo nel tempo, perché può esserci una deriva tissutale nel tempo.

6. Seleziona deltaMPET/MPET₀ nel menu a discesa del modulo Controlli di gruppo. Fai clic sul campo baseline# e inserisci gli indici (ad esempio, 1 2 3 4 5 per le prime cinque immagini del gruppo creato nel passaggio 2.3). Questo definirà le immagini utilizzate per calcolare la durata di base (LT₀).

7. Fare clic su Plot per generare un grafico contenente la risposta FLIM (ΔLT/LT₀) di tAKARα durante l'esperimento nelle ROI definite. Le variazioni normalizzate della durata di vita (ΔLT) delle singole ROI in base alla corrispondente durata di base (LT₀) consentono di confrontare l'attività di PKA durante la locomozione tra diverse ROI.

Results

Materials