Visualizzazione tridimensionale di un'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale del topo

Abstract

Fonte: Zaeck, L., et al. Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia in tessuto cerebrale eliminato con solvente. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra il processo di preparazione e imaging del tessuto cerebrale di topo infettato dal virus della rabbia (RABV) per valutare la progressione dell'infezione. Descrive i passaggi chiave, tra cui la colorazione dei tessuti con marcatori fluorescenti, la disidratazione, la pulizia e il montaggio per la microscopia a scansione laser confocale, culminando nella generazione di una rappresentazione tridimensionale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica animale appropriato. {{TAG_6 TAG_7}}

{È stato utilizzato materiale cerebrale archiviato infetto da RABV, fissato con paraformaldeide (PFA).

{ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza varie sostanze tossiche e/o nocive, tra cui PFA, metanolo (MeOH), perossido di idrogeno (H₂O₂), azidre di sodio (NaN₃), tert-butanolo (TBA), alcool benzilico (BA), benzoato di benzile (BB) ed etere di difenile (DPE). MeOH e TBA sono altamente infiammabili. Evitare l'esposizione indossando dispositivi di protezione individuale adeguati (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi) e conducendo esperimenti in una cappa aspirante. Raccogliere i rifiuti separatamente in appositi contenitori e smaltirli secondo le normative locali. Il virus della rabbia è classificato come agente patogeno con livello di biosicurezza (BSL)-2 e può, quindi, essere generalmente maneggiato in condizioni BSL-2. Alcune attività, comprese le procedure che possono generare aerosol, lavorare con alte concentrazioni di virus o lavorare con nuovi lissavirus, possono richiedere la classificazione BSL-3. La profilassi pre-esposizione è raccomandata per il personale ad alto rischio, compresi i custodi degli animali e gli operatori di laboratorio. Fare riferimento alle normative delle autorità locali.

1. Fissazione del tessuto cerebrale e sezionamento

1. Fissare i campioni cerebrali in un volume appropriato di PFA al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS [pH 7,4]) per almeno 48 ore a 4 °C (con un rapporto tessuto/fissazione approssimativo di 1:10 [v/v]).
2. Lavare i campioni di tessuto 3 volte in PBS per almeno 30 minuti ad ogni lavaggio e conservarli in NaN allo 0,02% ₃/PBS a 4 °C fino al momento dell'uso.
3. Sezionare il tessuto in sezioni di 1 mm di spessore utilizzando un vibratomo (velocità di avanzamento della lama: 0,3-0,5 mm/s, ampiezza: 1 mm, spessore della fetta: 1.000 μm).
4. Per mantenere la corretta sequenza di fette, conservare ogni sezione di tessuto separatamente in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare multipozzetto. Aggiungere 0,02% di NaN₃/PBS e conservare le sezioni di tessuto a 4 °C fino al momento dell'uso.

2. Pretrattamento del campione con metanolo

NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione con un'oscillazione delicata e, se non diversamente indicato, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Il pretrattamento del campione ha lo scopo generale di migliorare la diffusione degli anticorpi e ridurre l'autofluorescenza tissutale mediante esposizione a MeOH e H₂O₂, rispettivamente.

1. Preparare soluzioni di MeOH al 20% (v/v), 40%, 60% e 80% in acqua distillata. Ad esempio, per il 20% di MeOH, aggiungere 10 mL di MeOH al 100% a 40 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare capovolgendolo.
2. Trasferire i campioni in recipienti di dimensioni ragionevoli (ad es. provette di reazione da 5 mL). Fare attenzione ad utilizzare materiali chimicamente resistenti ai reagenti utilizzati in questo protocollo. Ad esempio, si noti che mentre il polipropilene è adatto, il polistirene non lo è.
   NOTA: Le specifiche del volume in questo protocollo si riferiscono a provette di reazione da 5 ml. Se si utilizza un recipiente diverso, regolare i volumi di conseguenza.
3. Incubare i campioni in 4 mL di ciascuna concentrazione della serie preparata di soluzioni di MeOH in ordine crescente per 1 ora ciascuna.
4. Incubare i campioni 2 volte per 1 ora ciascuno in puro (100%) MeOH.
5. Raffreddare i campioni a 4°C (ad esempio, in un frigorifero da laboratorio).
6. Preparare una soluzione sbiancante (5% H₂O₂ in MeOH) diluindo, ad esempio, una soluzione madre al 30% di H₂O₂ a 1:6 in MeOH puro (100%) e raffreddarlo a 4 °C.
7. Rimuovere il 100% di MeOH dai campioni refrigerati e aggiungere 4 mL di soluzione sbiancante prerefrigerata (5% H₂O₂ in MeOH). Incubare per una notte a 4 °C.
8. Scambiare la soluzione sbiancante con 4 mL di MeOH all'80% e incubare per 1 ora. Continuare a utilizzare la serie preparata di soluzioni di MeOH in ordine decrescente per 1 ora ciascuna fino a quando i campioni non sono stati incubati per 1 ora in 4 mL di MeOH al 20%.
9. Lavare i campioni 1 volta per 1 ora con 4 ml di PBS.

3. Immunocolorazione

NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione con un'oscillazione delicata e, se non diversamente indicato, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Per prevenire la crescita microbica, aggiungere NaN₃ a una concentrazione finale dello 0,02% alle soluzioni in questa sezione. I campioni di tessuto vengono ulteriormente permeabilizzati mediante trattamento con detergenti non ionici Triton X-100 e Tween 20. Il siero normale viene utilizzato per bloccare il legame degli anticorpi aspecifici. La glicina e l'eparina vengono aggiunte per ridurre lo sfondo di immunomarcatura.

1. Lavare i campioni 2 volte per 1 ora ciascuno in 4 mL di Triton X-100/PBS allo 0,2%.
2. Permeabilizzare i campioni per 2 giorni a 37 °C con 4 mL di Triton X-100/20% dimetil solfossido (DMSO)/0,3 M glicina/PBS.
3. Bloccare il legame aspecifico degli anticorpi incubando i campioni per 2 giorni a 37 °C in 4 mL di Triton X-100/10% DMSO/6% siero normale/PBS.
   NOTA: Utilizzare siero normale della stessa specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario per ottenere risultati di blocco ideali.
4. Incubare i campioni in 2 mL di soluzione di anticorpi primari (3% siero normale/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con eparina] + anticorpo/anticorpi primari) per 5 giorni a 37 °C. Rinfrescare la soluzione di anticorpi primari dopo 2,5 giorni.
   1. Per PTwH, ricostituire il sale sodico di eparina in acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 10 mg/mL (conservare questa soluzione, aliquotata, a 4 °C). Aggiungere la soluzione madre allo 0,2% di Tween 20/PBS fino a una concentrazione finale di 10 μg/mL.
      NOTA: La scelta della corretta diluizione degli anticorpi può richiedere un'ottimizzazione. In generale, le concentrazioni standard di immunoistochimica sono un buon punto di partenza.
5. Lavare i campioni per 1 giorno in 4 mL di PTwH, sostituendo il tampone di lavaggio almeno 4-5 volte durante il giorno e lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.
6. Incubare i campioni in 2 mL di soluzione di anticorpi secondari (3% di siero normale/PTwH + anticorpo/anticorpi secondari) per 5 giorni a 37 °C. Rinfrescare la soluzione di anticorpi secondari dopo 2,5 giorni.
   1. Diluire l'anticorpo/gli anticorpi secondari a 1:500 in soluzione di anticorpi secondari (cioè 4 μL in 2 mL).
7. Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale durante la notte.

4. Colorazione nucleare

NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione con un'oscillazione delicata e, se non diversamente indicato, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Se non è richiesta alcuna colorazione nucleare o se la lunghezza d'onda di eccitazione/spettro di emissione del rosso tiazolo (TO-PRO-3) è necessaria per l'eccitazione o il rilevamento di un altro fluoroforo, saltare questo passaggio.

1. Diluire la colorazione dell'acido nucleico TO-PRO-3 a 1:1.000 in PTwH e incubare i campioni in 4 mL di soluzione di colorazione nucleare per 5 ore.
2. Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale durante la notte.
   NOTA: Dopo i lavaggi, i campioni possono essere conservati in PBS a 4 °C fino alla pulizia ottica.

5. Pulizia dei tessuti

NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione con un'oscillazione delicata e, se non diversamente indicato, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. I campioni di tessuto vengono disidratati in una serie graduata di soluzioni TBA. Poiché l'immunocolorazione richiede soluzioni acquose, tutte le procedure di colorazione devono essere completate prima della pulizia dei tessuti. La clearance ottica e la corrispondenza dell'indice di rifrazione si ottengono mediante trattamento con una miscela di BA, BB e DPE. La soluzione schiarente è integrata con DL-α-tocoferolo come antiossidante.

1. Preparare soluzioni TBA al 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% in acqua distillata. Ad esempio, per il 30% di TBA, aggiungere 15 mL di TBA al 100% a 35 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare capovolgendo.
   NOTA: TBA ha un punto di fusione di 25-26 °C; quindi, tende ad essere solido a temperatura ambiente. Per preparare le soluzioni TBA, riscaldare il flacone ben sigillato a 37 °C in un'incubatrice o in un bagnomaria.
2. Disidratare i campioni con 4 mL di ciascuna concentrazione della serie preparata di soluzioni TBA in ordine crescente per 2 ore ciascuna. Lasciare il 96% TBA durante la notte.
3. Disidratare ulteriormente i campioni in TBA puro (100%) per 2 ore.
4. Preparare la soluzione di chiarificazione BABB-D15.
   NOTA: BABB-D15 è una combinazione di BA e BB (BABB) che viene miscelato con DPE in un rapporto di x:1, dove x è specificato nel nome della soluzione, In questo caso 15.
   1. Per BABB, mescolare una parte di BA con due parti di BB.
   2. Miscelare BABB e DPE con un rapporto di 15:1.
   3. Aggiungere 0,4% in volume di DL-α-tocoferolo (vitamina E).
      NOTA: Ad esempio, per 20 mL di BABB-D15, miscelare 6,25 mL di BA con 12,5 mL di BB. Aggiungere 1,25 mL di DPE e integrarlo con 0,08 mL di DL-α-tocoferolo.
5. Eliminare i campioni in soluzione di chiarificazione fino a renderli otticamente trasparenti (2-6 ore).
6. I campioni possono essere conservati a 4 °C in BABB-D15, al riparo dalla luce, fino al montaggio e all'imaging.

6. Montaggio del campione

1. Utilizzando una stampante 3D, stampare la camera di imaging e il coperchio (materiale: copoliestere [CPE], ugello: 0,25 mm, altezza dello strato: 0,06 mm, spessore della parete: 0,88 mm, conteggio delle pareti: 4, riempimento: 100%, nessuna struttura di supporto).
2. Assemblare la camera di imaging (Figura 1).
   1. Montare un vetrino coprioggetti rotondo (diametro: 30 mm) sulla camera di imaging con gomma siliconica RTV-1 (vulcanizzante monocomponente a temperatura ambiente). Rimuovere la gomma siliconica in eccesso con un batuffolo di cotone bagnato con acqua e polimerizzare durante la notte.
   2. Montare un vetrino coprioggetti rotondo (diametro: 22 mm) sul coperchio con gomma siliconica RTV-1. Rimuovere la gomma siliconica in eccesso con un batuffolo di cotone bagnato con acqua e polimerizzare durante la notte.
3. Posizionare il campione in una camera di imaging, aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 e inserire il coperchio. Riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'ingresso, utilizzando un ago ipodermico (27 G x 3/4 pollici [0,40 mm x 20 mm]).
4. Tappare l'ingresso e sigillare la camera di imaging con gomma siliconica RTV-1. Polimerizzare durante la notte al buio.

7. Imaging ed elaborazione delle immagini

1. Imposta l'acquisizione dell'immagine selezionando le rispettive linee laser in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati. Regolare i campi di rilevamento di ciascun rilevatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali.
   NOTA: I campi di rilevamento esemplari per Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e TO-PRO-3 sono rispettivamente 500-550 nm, 590-620 nm e 645-700 nm.
2. Scegli i parametri di acquisizione, definisci il bordo superiore e inferiore dello z-stack e acquisisci lo stack di immagini.
   NOTA: I parametri di acquisizione esemplari sono una scansione sequenziale con una dimensione dei pixel di 60-90 nm, una dimensione del passo z di 0,5 μm, una media delle linee di 1, una velocità di scansione di 400 Hz e una dimensione del foro stenopeico di 1 unità Airy.
3. Elabora la pila di immagini utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato (ad es. Fiji) per generare proiezioni 3D o eseguire analisi approfondite.
   NOTA: A causa delle grandi dimensioni dei file immagine acquisiti, l'uso di una workstation è solitamente necessario.
   1. Apri i file di acquisizione o immagine nelle Figi (File |{ {TAG_589}} Apri | Seleziona i file).
      1. Se si utilizzano, ad esempio, file LIF, selezionare o deselezionare le opzioni desiderate nella finestra di dialogo Bio-Formattazioni. Visualizza stack con Hyperstack. A parte questo, non sono necessarie selezioni o segni di spunta specifici. Premere OK.
      2. Se il file contiene più pile di immagini, selezionare quelle da analizzare e confermare premendo OK.
   2. Esegui la correzione della decolorazione dividendo l'immagine unita in singoli canali (Immagine: |{ {TAG_645}} Colore | Strumento Canali, quindi seleziona Altro | Canali Divisi}). Per ogni canale, seleziona la correzione della candeggina (Immagine | Regola {{TAG_681 TAG_682}}{{}}) e scegli Rapporto semplice (intensità dello sfondo: 0.0).
      NOTA: In alcuni casi, per esempio, quando non c'è decadimento lineare del segnale o il segnale è complessivamente troppo debole, Rapporto semplice potrebbe fallire. In alternativa, prova Exponential Fit o salta la correzione dello sbiancamento.
   3. Regola la luminosità e il contrasto per ogni canale usando i cursori (Immagine: |{ {TAG_724}} Regola | Luminosità | Contrasto).
   4. Unisci i canali (Image |{ {TAG_754}} Colore | Unisci canali), crea un composto (Immagine | Colore | , quindi seleziona Altro | Crea composito) e convertilo in formato RGB (Immagine | Colore | Canali Strumento, quindi seleziona Altri | Converti in RGB).
   5. Se necessario, ridimensionare la pila di immagini per ridurre il tempo di calcolo e le dimensioni del file (Immagine | Adjust | , entrambe le opzioni sono selezionate più l'interpolazione bilineare).
   6. Genera una proiezione 3D (Immagine | TAG_865}}| Progetto 3D}). Scegli Punto più luminoso come metodo di proiezione e imposta la spaziatura delle sezioni in modo che corrisponda alla dimensione del passo z della pila di immagini acquisita. Per ottenere la massima qualità, impostare l'incremento dell'angolo di rotazione su 1 e abilitare l'interpolazione. Modificate la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze.
   7. Se necessario, regolare nuovamente il contrasto e la luminosità convertendo la proiezione 3D in formato a 8 bit (Immagine | Tipo | 8-bit). Utilizzare i rispettivi cursori (Immagine | Regola | Luminosità | Contrasto) e riconvertire lo stack di immagini in formato RGB come descritto nel passaggio 7.3.4.
   8. Salvate la proiezione 3D come . TIF (formato file immagine) e file .AVI (formato file video).

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