Utilizzo della riflettometria spettrale per determinare i diametri degli assoni mielinizzati in una fetta fissa di cervello di topo

Abstract

Fonte: Kwon, J., et al., Microscopia riflettometrica spettrale su assoni mielinizzati in situ. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'uso della riflettometria spettrale con un microscopio confocale iperspettrale per analizzare i modelli di interferenza e determinare i diametri degli assoni mielinizzati in fette fisse di tessuto cerebrale.

Protocollo

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p style='altezza-linea:1.799999999999999998;margine-fondo:0pt;margine-superiore:12pt;' dir='ltr'>Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dalla revisione etica animale appropriata comitato.

1. Calibration

1. Accendi il microscopio almeno 1 ora prima dell'imaging per consentire la stabilizzazione termica della sorgente laser (vedi Tabella dei materiali). Quindi, accendi il software per la scansione spettrale (vedi Tabella dei materiali) e fai clic sul pulsante Acquisisci nella parte superiore della GUI (interfaccia utente grafica) (Figura 1a).
2. Attiva l'otturatore del software per il laser a luce bianca (WLL) e il tubo fotomoltiplicatore (PMT) (Figura 1a).
3. Selezionare la modalità xyΛ nell'elenco a discesa in Modalità di acquisizione, quindi la modalità di ingresso laser viene automaticamente modificata da Percentuale costante a Potenza costante. Deseleziona la casella di controllo di Movimento SP automatico. Quindi, imposta la finestra spettrale del laser in ingresso a 470–670 nm e la dimensione del passo spettrale a 4 nm su Λ-Excitation Lambda Scan Settings (Figura 1b).
4. IMPOSTA l'intervallo spettrale di PMT su 450-690nm facendo doppio clic o spostando la barra di regolazione per l'intervallo spettrale (Figura 1c).
   Nota: Questa gamma spettrale dovrebbe includere l'intera larghezza di banda della sorgente di ingresso.
5. Seleziona un obiettivo a immersione in acqua, adatto con un'apertura numerica elevata (NA > 0,7) e dai qualsiasi valore a PMT e potenza laser per attivare AOBS (Acousto-optic beam splitter) configurazione e pulsante Live Scan. Cambia il percorso ottico controllando la riflessione nella configurazione AOBS (Figura 1d).
6. Montare uno specchio di riferimento (vedere la tabella dei materiali) sul tavolino del microscopio. La superficie dello specchio deve essere rivolta contro la lente dell'obiettivo. Se non è facile montare lo specchio sul tavolino del microscopio, incollare uno specchio su una lastra piana (e.g., slide vetro).
7. Controllare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla superficie dello specchio.
8. Regolare il guadagno PMT e la potenza del laser, considerando la gamma dinamica del rivelatore, quindi modificare la modalità di ingresso laser da Percentuale costante a Potenza costante.
   Nota: Come è tipico, a 570 nm vengono utilizzati un guadagno PMT di 500 (V) e una potenza laser relativa dello 0,1%.
9. Confermare in una modalità pseudo-colore per verificare che non vi sia saturazione in tutta la gamma di lunghezze d'onda. Se si osserva una saturazione, ridurre la potenza del laser (Figura 1a).
10. Esegui l'acquisizione Lambda Scan.
11. Rimuovi lo specchio dal palco e ripeti la stessa acquisizione senza un campione per ottenere il riferimento scuro (i.e., offset scuro).
12. Salva i dati in un formato TIF multistack.

2. SpeRe (Riflettometria spettrale) Acquisizione immagini

1. Posiziona il tessuto montato sul tavolino del microscopio. Per allineare approssimativamente il tessuto al piano focale della lente dell'obiettivo, utilizzare la modalità di fluorescenza ad ampio campo attraverso un oculare.
2. Con il Live Scan poi, controllare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla regione di interesse nel tessuto. Per evitare il rumore di fondo del vetrino coprioggetti, selezionare la regione target di almeno 15 μm di profondità dall'interfaccia vetro-tessuto.
3. Acquisire lo stack di immagini spettrali per la regione target utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi da 1.1 a 1.10.
4. Salva i dati per il tessuto e l'offset scuro in un Multistacked TIF formato.
   Nota: Il Lo sperimentatore può fare una pausa in questa fase.

3. Elaborazione e analisi delle immagini

1. Aprire i dati spettrali (TIF multi-stacked) per lo specchio di riferimento e il tessuto cerebrale in ImageJ.
2. Seleziona le ROI (regioni di interesse) per le pile di immagini aperte: l'area centrale per lo specchio di riferimento e il segmento di una fibra assonale per il tessuto cerebrale.
3. Acquisisci gli spettri grezzi per le ROI selezionate eseguendo Image → Stacks → Traccia profilo asse Z<span style='famiglia-carattere:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;'> nel menu ImageJ.
4. Apri i dati di offset scuro, uno preso per lo specchio di riferimento e l'altro preso per il tessuto cerebrale.
5. Acquisisci gli spettri per gli offset scuri eseguendo Image → Stacks → Traccia profilo asse Z<span style='famiglia-carattere:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;'> nel menu ImageJ.
6. Salva tutti gli spettri acquisiti utilizzando il Copia e incolla opzioni.
   Nota: Per l'imaging SpeRe, si consiglia l'uso del campo di imaging centrale per ridurre al minimo le aberrazioni ottiche fuori asse. Le fibre degli assoni possono essere strutturalmente eterogenee lungo la loro lunghezza. Pertanto, si consiglia di selezionare il ROI su un segmento di assone piccolo, in genere < 5 μm, per ridurre al minimo gli artefatti di volume parziale.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo apocromatico 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Tipo ad immersione in acqua.
Fluoromielina verde	Thermo Fisher	F34651
Leica SP8 TCS microscopio	Leica Microsystems	SP8
Software di imaging	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Rivestito con argento protetto.
Vetrino coprioggetto	Thermo Fisher	3306	Spessore: #1 (da 0,13 a 0,17 mm).
Vetrino	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Spessore: ~1 mm.
�	Henkel	Loctite 406	Utilizzare un'apparecchiatura di erogazione per evitare il contatto con la pelle o gli occhi.
Laser a luce bianca	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 è stato interrotto e sostituito da EXU-6.

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