Visualizzazione delle proiezioni dei motoneuroni e della ramificazione degli assoni mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Abstract

Fonte: <a style='decorazione testo:nessuno;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'>Liau, E. S. et al. Visualizzazione della navigazione degli assoni motori e quantificazione dell'arborizzazione degli assoni negli embrioni di topo utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio leggero. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra l'uso della microscopia a fluorescenza a foglio di luce per visualizzare le proiezioni dei motoneuroni e la ramificazione degli assoni embrioni di topo transgenici. Delinea le fasi coinvolte nella preparazione del campione, nell'imaging e nella ricostruzione 3D della ramificazione assonale per valutare la crescita e la connettività dei motoneuroni.

Protocol

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p style='altezza-linea:1.2;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;text-align:giustificare;' dir='ltr'>Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'etica animale appropriata comitato di revisione.

1. Microscopia a fluorescenza su foglio leggero (LSFM) (2–3 h)

1. Esempio di configurazione
   1. Imposta un'ottica di illuminazione 5X/0.1 e un'ottica di rilevamento 5X/0.16. Assemblare il portacampioni e il capillare del campione (diametro interno 1,5 mm, verde) e inserirli nel microscopio.
      NOTA: Fare riferimento al Manuale d'uso del microscopio per le procedure di configurazione dettagliate.
   2. Monta l'embrione come segue:
      1. Prepara la punta della pipetta P200 tagliando via la parte superiore in modo che si adatti al diametro del capillare e rimuovi la parte appuntita (~ 3 mm) per l'attacco del campione.
      2. Sciogliere l'estremità smussata del puntale della pipetta usando una piccola fiamma.
      3. Spegni la fiamma e attacca rapidamente l'embrione verticalmente all'estremità fusa.
      4. Inserire la parte superiore del puntale della pipetta con il capillare del campione.
   3. Lasciare che il tampone della camera si equilibri con l'embrione per 1 minuto per eliminare detriti o bolle.
   4. Utilizzando il software di imaging, seleziona Individua capillary sotto il Individua e regola gli assi x, y e z per posizionare il capillare del campione.
   5. Seleziona Individua campione e ingrandisci a 0,6X per mettere a fuoco l'embrione. Ruota l'embrione per assicurarti che l'asse lungo dell'arto ripreso si allinei con il percorso luminoso delle due fonti di luce (Figura 1B).
2. Acquisizione immagini
   1. Sotto il Acquisizione scheda, definisci i parametri del percorso luminoso come obiettivi di rilevamento, filtro di blocco laser, divisore di raggio, telecamere e laser.
      NOTA: In questo esperimento viene utilizzato il canale della proteina fluorescente verde (GFP) (lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm; filtro di emissione: passa-banda (BP) da 505 a 545 nm; divisore di fascio: SPS LP 560).
   2. Selezionare la casella di controllo scansione pivot per la riduzione delle ombre.
   3. Definisci le impostazioni di acquisizione: profondità di bit, 16 bit; zoom, 0,36-0,7X; Illuminazione su un lato (sinistra/destra) o su due lati.
   4. Fai clic su Continuo e impostare l'intensità del laser, il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione del foglio luminoso per acquisire immagini più nitide.
      NOTA: La potenza del laser viene mantenuta il più bassa possibile per ridurre al minimo il fotodanneggiamento.
   5. Premi STOP <span style='famiglia-carattere:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;'>per terminare l'acquisizione dell'immagine.
3. Acquisizione multidimensionale
   1. Definisci lo z-stack spostando la posizione Z per la prima e l'ultima immagine. Clicca <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Optimal per impostare il numero di fetta.
   2. Fai clic su Inizia esperimento per acquisire lo z-stack selezionato.
   3. Al termine, salva l'immagine in formato .czi.
4. Elaborazione delle immagini (opzionale)
   1. Procedi con Fusione su due lati sotto il Elaborazione del foglio luminoso se viene applicata l'illuminazione a doppio lato. Elaborazione multiview è necessario se vengono acquisite più viste per combinare immagini da più angolazioni.
   2. Crea un'immagine 2D utilizzando i dati dei pixel di intensità più alta lungo l'asse di proiezione sotto il Massima intensità di proiezione canale.
   3. Sotto il Copy canale, clicca sottoinsieme per selezionare sottoinsiemi di immagini dal set originale.

2. Quantificazione dell'arborizzazione degli assoni (30 min per ogni singolo nervo)

1. Apri il file immagine nel software di analisi delle immagini (per impostazione predefinita, l'immagine contenente i dati XYZ viene aperta in modalità Surpass e come vista renderizzata in 3D).
2. Regola il colore, la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando il Display Adjustmentwindow (Modifica | Mostra la regolazione del display) per rilevare i filamenti in base al contrasto di intensità locale.
3. Fai clic su Add New Filaments icona e seleziona l'icona Autopath (nessun ciclo) nel menu a discesa.
4. Selezionare la regione di interesse (in questo caso, l'assone di segmentazione di interesse). Fai clic su Prossimo quando finito.
5. Definisci i punti di partenza e di partenza assegnando le misure di diametro più grandi e sottili, che possono essere misurate utilizzando il Slice modalità.
6. Assegna un punto di partenza al bordo della regione di interesse. Per ottenere l'aggiunta o la rimozione manuale dei punti iniziali, prima cambia la modalità del puntatore (Navigate | Seleziona) e poi Maiusc + clic destro nei punti di interesse.
7. Selezionare le soglie manuali per i punti di semina per assicurarsi che tutta l'arborizzazione visibile sia contrassegnata. Cambia la modalità del puntatore (Navigate | Seleziona) e poi Maiusc + clic sinistro nei punti di interesse per aggiungere o rimuovere manualmente i punti di partenza.
   NOTA: È importante rimuovere manualmente i rumori di fondo e i segnali dai nervi vicini.
8. Seleziona la casella Rimuovi i punti di partenza attorno ai punti iniziali<span style='famiglia di caratteri:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;'>.
9. Controlla Rimuovi segmenti disconnessi per consentire l'esclusione di punti che sono troppo lontani e che possono rappresentare un rumore di fondo. Indica il Maximum Gap Length nel prossimo passaggio per definire il limite superiore per esclusione.
10. Regola la soglia per la sottrazione dello sfondo, che utilizza un filtro gaussiano per stimare l'intensità dello sfondo di ogni voxel.
11. Imposta la soglia automatica per il diametro del dendrite utilizzando il Area della sezione trasversale approssimativa algoritmo.
12. Salta i passaggi per il calcolo della colonna vertebrale.
13. Termina il processo e scegli lo stile e il colore desiderati.
14. Deseleziona la casella del volume in Proprietà per visualizzare solo gli assoni ricostruiti.
15. Sotto il Statistics tab, seleziona Dettagliato. Usa Filament No. Dendrite Terminal Points per quantificare i terminali nervosi motori come indicatore dell'arborizzazione dell'assone motorio.
    NOTA: Statistico Se lo si desidera, è possibile aggiungere un'annotazione.
16. Esporta l'immagine dell'assone ricostruito come file .tif.

Results

Materials