Imaging istochimico di moduli corticali in sezioni cerebrali appiattite

Abstract

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p style='altezza-linea:1.2;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'>Fonte: Lauer, S. M., et al. Visualizzazione dei moduli corticali in cortecce di mammiferi appiattite. J. Vis. Exp. <span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>(2018)

Questo video mostra un metodo per visualizzare i moduli corticali in sezioni cerebrali appiattite utilizzando la colorazione istochimica. Le sezioni prefissate vengono trattate con un reagente di tensione che evidenzia i cluster neurali attivi, formando regioni scure ad alto contrasto. Dopo il montaggio e la disidratazione, i moduli corticali appaiono al microscopio a campo chiaro come modelli scuri e irregolari.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Visualizzazione dei moduli corticali utilizzando la colorazione con citocromo ossidasi

NOTA: Sono stati sviluppati diversi protocolli di colorazione per la rilevazione istochimica dell'attività della citocromo ossidasi. Questo protocollo utilizza il solfato di nichel-ammonio (NiAS), ottenendo un contrasto più elevato e moduli meglio definiti nelle aree corticali colorate.

1. Preparare la soluzione colorante con citocromo ossidasi. Per 10 mL di soluzione, aggiungere 10 mL di tampone 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) (0,1 M, pH 7,4), 400 mg di saccarosio, 12,5 mg di NiAS, 2 mg di citocromo C e 6 mg di diaminobenzidina (DAB).
   ATTENZIONE: DAB e NiAS sono cancerogeni.
   NOTA: Aggiungi DAB appena prima dell'incubazione delle sezioni.
2. Lavare le sezioni in tampone HEPES (0,1 M, pH 7,4) su un agitatore per 15 minuti.
3. Incubare le sezioni nella soluzione colorante a temperatura ambiente su un agitatore.
   NOTA: Osservare la velocità della colorazione. Se non c'è alcuna reazione visibile, passare all'incubazione a 37 °C. A seconda della quantità di fissazione, la colorazione può essere osservata dopo 10 minuti o dopo diverse ore.
4. Arrestare la reazione aggiungendo il 4% di paraformaldeide (PFA); Ciò impedisce la ri-morte indesiderata e un aumento del segnale di fondo.
5. Lavare le sezioni tre volte utilizzando il tampone HEPES per 10 min.
6. Montare e asciugare le sezioni su vetrini.
7. Disidratare le sezioni con una fila di alcol crescente:
   1. Lavare i vetrini in etanolo al 60% per 1 minuto. Lavare i vetrini in etanolo all'80% per 1 minuto. Lavare i vetrini in etanolo al 96% per 2 minuti. Lavare i vetrini in etanolo al 100% per 3 minuti. Lavare i vetrini in isopropanolo per 5 minuti. Lavare i vetrini in xilene per 5 minuti.
8. Aggiungere immediatamente un mezzo di montaggio a indurimento rapido e aggiungere un vetrino coprioggetti. Critico: Non utilizzare mezzi di montaggio a base d'acqua, poiché NiAS verrà lavato via e degraderà la colorazione.
9. Conservare le sezioni a 4 °C per una conservazione a lungo termine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Colorazione con citocromo ossidasi
Citocromo c da cuore equino	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidina tetracloridrato idrato	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Mezzi
Eukitt (istochimica)	Sigma-Aldrich	3989
Disidratazione
Etanolo 100%	Carl Roth	9065.3
Etanolo 96%	Carl Roth	P075.3
2-propanolo	Carl Roth	6752.4
Sostituto dello xilene	Fluka	78475
Dispositivi/strumenti
Dumont 55 Pinze - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont 5 Pinze - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont 5SF Pieps - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00

di montaggio o congelamentoalcolica