Analisi delle cellule immunitarie nei tessuti nervosi di topo mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Hidmark, A. S., et al. Analisi delle cellule immunitarie in singoli nervi sciatici e ganglio della radice dorsale da un singolo topo utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).

Questo video dimostra l'uso della citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nei nervi sciatici di topo e nei gangli delle radici dorsali (DRG). Il processo prevede la marcatura delle cellule immunitarie con anticorpi marcati con fluorofori e biotina, la stabilizzazione e la permeabilizzazione delle cellule e l'utilizzo di marcatori fluorescenti per rilevare le caratteristiche della superficie cellulare e del nucleo. La tecnica consente una valutazione quantitativa dell'eterogeneità delle cellule immunitarie nei tessuti nervosi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Digestione del nervo sciatico e DRG

1. Preparare il terreno di digestione (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico [HEPES], 5 mg/mL di albumina sierica bovina [BSA], 1,6 mg/mL di collagenasi di tipo 4) integrati con 100 μg/mL di desossiribonucleasi, e conservare sul ghiaccio.
   NOTA: La quantità di terreno di digestione richiesta per topo (nervi sciatici + DRG) è di 1 ml. Una volta preparate, le aliquote del mezzo di digestione possono essere conservate a -20 °C.
2. Trasferire i nervi sciatici e i DRG da un topo in provette separate da 1,5 ml contenenti 500 μl di terreno di digestione. Per i nervi sciatici, tagliare il materiale in 15-20 pezzi con le forbici a molla e poi incubare le sospensioni tissutali in un'incubatrice agitata a 37 °C per 20 minuti con una leggera agitazione (≤ 450 giri/min).
3. Triturare ripetutamente la sospensione cellulare attraverso la punta della pipetta da 1.000 μl per dissociare meccanicamente il tessuto non completamente digerito.
   NOTA: Se la sospensione è difficile da titolare, tagliare la punta della pipetta con le forbici per creare un'estremità smussata. Incubare la sospensione tissutale a 37 °C per 20 minuti agitando delicatamente (≤ 450 giri/min).
4. Ripetere la triturazione attraverso un puntale per pipetta da 1.000 μl e incubare per altri 10 minuti a 37 °C con agitazione delicata (≤ 450 giri/min).
5. Preparare il tampone FACS (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] integrata con il 10% di siero fetale di vitello [FCS] e 1 mM di acido etilendiammina tetraacetico [EDTA]) e conservare in ghiaccio. Sciacquare e immergere uno schermo in acciaio inossidabile con una dimensione delle maglie di 140 μm con tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) in una piastra di Petri da 60 x 15 mm su ghiaccio.
   NOTA: I filtri a schermo in nylon dovrebbero essere evitati in quanto portano a una significativa perdita della resa delle cellule nucleate.
6. Far passare ripetutamente le sospensioni tissutali attraverso il filtro a schermo da 140 μm, poiché viene tenuto sopra la capsula di Petri, con una pinza smussata, sul ghiaccio. Raccogliere la sospensione cellulare dalla capsula di Petri e trasferirla in una nuova provetta da 1,5 mL conservata in ghiaccio.
7. Spingere il tessuto non completamente digerito che rimane sul filtro mediante triturazione ripetuta con un puntale per pipetta da 1.000 μl. Sciacquare due volte il filtro a rete con 500 μl di tampone FACS e raccogliere la sospensione cellulare risultante nella piastra di Petri per combinarla con la sospensione cellulare del passaggio 1.6.
   NOTA: Se il citometro a flusso utilizzato è sensibile ai detriti, la sospensione cellulare dal passaggio 1.7 può essere fatta passare attraverso un filtro a schermo da 70 μm; Tuttavia, questo può portare a una perdita della resa delle cellule nucleate.
8. Centrifugare le sospensioni cellulari a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone FACS. Ripetere questa fase di lavaggio una volta.
9. Risospendere il pellet della cella in 150-350 μL di tampone FACS, a seconda del numero di colorazione richiesto (150 μL di tampone FACS per pannello di colorazione).

2. Colorazione del nervo sciatico e DRG con anticorpi marcati in fluorescenza per citometria a flusso

1. Trasferire 100 μL del nervo sciatico o della sospensione cellulare DRG in un pozzetto a forma di V in una piastra a 96 pozzetti su ghiaccio.
   NOTA: Le cellule colorate singolarmente sono necessarie per tutti gli anticorpi utilizzati in quanto forniranno i controlli necessari per impostare la citometria a flusso per quanto riguarda i guadagni di tensione e la compensazione del tubo fotomoltiplicatore (PMT), nonché per aiutare a distinguere il legame specifico da quello non specifico.
2. Raggruppare le restanti sospensioni cellulari (circa 50 μl per campione) dai nervi sciatici o dai campioni DRG, per fungere da controllo non colorato.
3. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante capovolgendo la piastra su un contenitore e applicando un brusco movimento del polso, quindi picchiettare delicatamente su carta assorbente.
4. Per la colorazione superficiale, risospendere ciascuno dei pellet cellulari in 20 μL di tampone FACS contenente gli anticorpi di interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 e complesso maggiore di istocompatibilità [MHC] Classe II-Biotina) e incubare, al riparo dalla luce, su ghiaccio per 30 minuti.
   NOTA: (1) La diluizione ottimale degli anticorpi deve essere determinata prima dell'uso eseguendo una diluizione serie secondo le informazioni sul prodotto del produttore; (2) La colorazione aspecifica può essere ridotta mediante incubazione con blocco Fc in questa fase, secondo le istruzioni del produttore; e (3) La colorazione di controllo dell'isotipo non è generalmente richiesta quando si utilizzano anticorpi primari direttamente coniugati con un fluoroforo e/o quando l'antigene o gli antigeni di interesse producono popolazioni distinte.
5. Aggiungere 130 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto e centrifugare la piastra a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (passaggio 2.3) e lavare due volte i pellet della cella con 150 μl di tampone FACS.
   NOTA: Se si utilizza un anticorpo primario non coniugato o un anticorpo primario coniugato alla biotina, a questo punto è possibile aggiungere un reagente secondario appropriato, coniugato a un fluoroforo, e ripetere i passaggi 2.4-2.5. Nel caso di questo protocollo, la streptavidina-PE/Cy7 o la streptavidina-PerCP sono state utilizzate per rilevare MHC di Classe II in combinazione con CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, rispettivamente, o in combinazione con CD68-APC e F4/80-PE/Cy7.
6. Per il fissaggio, dopo l'ultima fase di lavaggio, risospendere i pellet cellulari in 100 μl di paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7,4). Incubare la piastra su ghiaccio per 10 minuti e poi centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (passaggio 2.3) e lavare una volta i pellet cellulari con 150 μl di tampone FACS.
   Attenzione: la paraformaldeide è tossica; Indossare protezioni adeguate come guanti e occhiali, ecc.
   NOTA: Risospendere i pellet di cella in 150 μL di tampone FACS e conservarli al riparo dalla luce, a 4° C per un massimo di due giorni. Se non è richiesta alcuna colorazione intracellulare, procedere al passaggio 2.11 dopo aver centrifugato la piastra a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Per la colorazione intracellulare, risospendere i pellet cellulari in 150 μL di tampone FACS +0,5% di detergente e incubare a temperatura ambiente, Protetto dalla luce per 15 min. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (passaggio 2.3) e lavare una volta il pellet della cella con 150 μl di tampone FACS + 0,5 % di detergente. Risospendere il pellet cellulare in 20 μL di tampone FACS+0,5% di detergente contenente gli anticorpi di interesse (CD68-APC, CD206-PE) e incubare, al riparo dalla luce, a temperatura ambiente per 30 min.
8. Aggiungere 130 μL di tampone FACS+0,5% di detergente in ciascun pozzetto e centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante come precedentemente descritto (passaggio 2.3) e lavare due volte i pellet della cella con 150 μl di tampone FACS+0,5 % di detergente.
   NOTA: Se si utilizza un anticorpo primario non coniugato o un anticorpo primario coniugato alla biotina, allora un reagente secondario appropriato, coniugato a un fluoroforo, può essere aggiunto a questo punto e i passaggi 2.9-2.10 ripetuti.
9. Risospendere i pellet di cella in 150 μL di tampone FACS+0,5% di detergente e conservare, al riparo dalla luce, a 4 °C per un massimo di due giorni.
10. Risospendere i pellet cellulari con 150 μL di tampone FACS + 0,5 % di detergente integrato con 5 μg/mL4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante come descritto in precedenza (punto 2.3).
11. Risospendere i pellet cellulari in 150 μl di PBS e trasferirli in una provetta FACs opportunamente etichettata. Conservare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, fino al momento dell'analisi.
    NOTA: Dopo la risospensione in PBS, le cellule dovrebbero essere analizzate entro poche ore, poiché il DAPI si dissocierà lentamente dal DNA, portando ad una perdita di segnale.

3. Impostazione della citometria a flusso e funzionamento dei campioni

1. Assicurarsi che il citometro a flusso sia dotato dei laser e/o dei set di filtri appropriati per misurare i fluorofori utilizzati per colorare le cellule. Questo può essere determinato nella configurazione predefinita del citometro sul sistema. Nel caso di questo protocollo, le cellule sono state analizzate utilizzando un citometro a flusso dotato di tre laser (405 nm, 488 nm e 633 nm) che consentono il rilevamento di ≤ 5 fluorofori.
2. Selezionare i canali appropriati per il rilevamento dei fluorofori di interesse. Tutti i segnali fluorescenti sono meglio rilevati con l'amplificazione logaritmica.
3. Selezionare una portata appropriata per i campioni. Questo parametro può variare a seconda del sistema utilizzato e deve essere determinato empiricamente. Nel caso di questo protocollo, è stata utilizzata una velocità di flusso da MED-a HI (35-60 μL/min) per prevenire l'intasamento dell'ago.
4. Selezionare il numero totale di eventi/celle da raccogliere per campione. Il numero minimo di eventi dovrebbe essere 1.000.000.
5. Crea grafici a dispersione in un foglio di lavoro globale dell'area di dispersione laterale (SSC-A) rispetto all'area di dispersione diretta (FSC-A), nonché per ogni fluoroforo di interesse rispetto a FCS-A. Crea una vista statistica che visualizzerà il numero di eventi e l'intensità media della fluorescenza (MFI) per i fluorofori selezionati.
6. Impostare la tensione dei canali FSC-A e SSC-A, in modo tale che le celle più piccole entrino nel 10% inferiore sinistro del grafico a dispersione. Determinare la fluorescenza di fondo e la fluorescenza minima del campione dai controlli non colorati dei nervi sciatici o dei DRG. Determinare il gate genitore (P1) in base al grafico a dispersione dei controlli di colorazione solo DAPI.
   NOTA: Questo non è un portale di raccolta, dovuto in parte alla natura eterogenea della popolazione DAPI+ nel sistema nervoso periferico (PNS).
7. Utilizzando i grafici di dispersione FSC per ciascuno dei fluorofori di interesse, regolare le tensioni in modo che le celle del controllo non colorato rientrino nel quarto inferiore dei rispettivi grafici di dispersione. Vengono quindi creati dei gate sopra questa regione per definire quelle celle che sono positive per ciascuno dei rispettivi marcatori/fluorofori. Il posizionamento di un cancello è confermato dall'esecuzione del comando a colorazione singola (passaggio 2.1).
   NOTA: La compensazione per gli spettri di emissione sovrapposti può essere eseguita a questo punto o applicata retrospettivamente con il software di analisi appropriato.
8. Una volta che il citometro a flusso è stato impostato, come descritto, i campioni possono essere analizzati.
9. Dopo la corsa, il materiale campione rimanente può essere scartato e i file FCS possono essere esportati per ulteriori analisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti C57BL/6 MouseCharles River style='colore:#1a202c;dimensione-carattere:12pt;overflow:nascosto;padding:0px 3px;allineamento verticale:bottom;'>C57BL/6NCrl DMEM (+1g/L glucosio, Glutammina, Piruvato)Thermo31885023La fonte di questo materiale non è importanteHEPESSigma-AldrichH3375 Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153 Collagenasi Tipo 4Worthington Biochemical Corp., USLS004188 Deossiribonucleasi (DNasi) I dal pancreas bovino ISigma-AldrichDN25-1g Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-AldrichE6758 Siero di vitello fetale (FCS), inattivato dal caloreSigma-AldrichF4135Anticorpo contro CD11b-PerCP/Cy5.5<td style='colore:#1a202c;dimensione-carattere:12pt;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;'>Biolegend101228Clone M1/70Anticorpo contro MHC classe II, biotinilatoBiolegend107603Clone M5/114.15.2Anticorpo contro CD45-A647Biolegend107603Clone 30-F11Streptavidin-PE/Cy7Biolegend405206Utilizzato per rilevare la biotina MHCII con CD45-A647 e CDllb-PerCP/Cy5.5Streptavidin-PerCPBiolegend405213Utilizzato per rilevare la biotina MHCII con CD68-APC e F4/80-PE/Cy7Triton-X 100Sigma-AldrichT8787 DAPISigma-AldrichD9542-1MGDiluisci in PBS a 50x e conservare a 4 °C al buioSetaccio di dissociazione cellulare - kit grinder per tessuti<td style='color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-AldrichCD1 Piastre a forma di V, 96 pozzettiGreiner/SigmaM8185 5ml tubo fondo tondo in polistirene, 12x75mmBD Biosciences352008 60x15mm piatto di Petri<td style='colore:#1a202c;dimensione-carattere:12pt;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento verticale:fondo;'>Greiner/SigmaZ643084 BD LSR II Citometro a flussoBD Biosciences