Imaging in vivo della retina di topo mediante tomografia a coerenza ottica

Abstract

Fonte: Jagodzinska, J., et. al., Tomografia a coerenza ottica: imaging delle cellule gangliari retiniche del topo In Vivo. J. Vis. Exp. (2017) <br />

In questo video, dimostriamo l'uso della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare gli strati retinici e valutare i cambiamenti strutturali in un modello murino geneticamente modificato con neuropatia ottica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del topo

1. Dilatazione e immobilizzazione dell'occhio
   1. Almeno 15 minuti prima dell'acquisizione dei dati, instillare il 10% di gocce oculari di fenilefrina negli occhi del topo, rimuovere l'eccesso, e instillare un collirio tropicale allo 0,5%.
      NOTA: La prima dilatazione può essere eseguita in una sola volta per tutti i topi che verranno testati nella sessione. Assicurarsi che i liquidi siano a temperatura ambiente.
   2. Immediatamente dopo aver indotto l'anestesia generale (passaggio 1.2), somministrare collirio di ossibuprocaina cloridrato allo 0,4%, mantenendole in posizione per 3 s per anestetizzare e immobilizzare gli occhi. Successivamente, rimuovere le gocce e ripetere l'instillazione di fenilefrina al 10% e tropicamide allo 0,5% per accertare che gli occhi siano ben dilatati.
      NOTA: Assicurati che i liquidi siano a temperatura ambiente e che il topo non ingoi l'ossibuprocaina.
2. Anestesia generale
   1. Preparare una soluzione anestetica di ketamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) in soluzione fisiologica. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   2. Circa 5 minuti prima del test, iniettare intraperitonealmente 5 - 10 μl di soluzione anestetica per 1 g di massa corporea, a seconda dell'età e delle dimensioni del topo.
      NOTA: I topi giovani e/o magri hanno bisogno di meno anestesia, impiegano meno tempo per anestetizzarsi, ma si risvegliano anche più velocemente. Qui, 8 μL/g (160 mg/kg di ketamina, 9,33 mg/kg di xilazina).
   3. Opzionalmente, lubrificare gli occhi con colliri viscosi o un gel oftalmico per evitare la secchezza corneale.

2. Posizionamento del mouse

1. Lubrificare gli occhi con colliri a base di glicole viscoso per fornire idratazione corneale.
   NOTA: Se gli occhi sembrano secchi durante l'esame, riapplicare il collirio.
2. Avvolgi il topo in un foglio di garza chirurgica per tenerlo al caldo.
3. Usando una spugna o uno stoppino di cotone, applica uno strato sottile di gel oftalmico con lo 0,3% di ipromellosa su ciascun occhio, per ridurre al minimo la rifrazione della luce, evitare opacità e garantire l'idratazione corneale. Nel farlo, sposta da parte le ciglia e i baffi.
4. Posizionare il mouse nella cassetta, con la testa dritta e rivolta in avanti.
5. Aprire delicatamente il morsetto della barra del morso e posizionare la barra in bocca; Utilizzare la fascia nasale per fissare la posizione.
   NOTA: Assicurarsi che la barra del morso sia al centro della cassetta.
6. Posiziona un rotolo di cotone sotto il lato destro (sinistro) se l'occhio destro (sinistro) viene testato.
7. Mantenendo la punta di puntamento a clip sull'obiettivo specifico del mouse, portarla verso l'occhio ruotando la vite del traslatore Z in senso antiorario.
8. Ruotando e ruotando la cassetta e ruotando la barra del morso e le viti X-traslatori, preimpostare la posizione del mouse; L'obiettivo è quello di far sì che l'occhio destro guardi direttamente nell'obiettivo e quindi di allineare gli assi ottici degli occhi e dell'obiettivo.
   NOTA: Se il mouse è troppo alto o troppo basso, la vite del traslatore Y dovrebbe essere utilizzata per prima.
9. Scegli la prima scansione in "Esame", fai clic su "Inizia a mirare" e apporta ulteriori regolazioni manuali per l'imaging della retina.
   1. Utilizzando la vite Z-translator, spostare la retina verticalmente sul pannello sinistro (Figura 1, Horizontal B-scan Alignment) e orizzontalmente sul pannello destro (Figura 1, Vertical B-scan Alignment).
   2. Ruotare la cassetta per portare l'ONH al centro del pannello destro spostando l'ONH verso l'alto o verso il basso. Utilizzare la vite della barra del morso per raddrizzare la retina sul pannello destro. Ruotare la cassetta per posizionare l'ONH al centro del pannello sinistro.
   3. Usa la vite X-translator per livellare la retina sul pannello sinistro. Tenendo presente la funzione principale di ciascun modulatore, regolare ulteriormente la posizione della retina per centralizzare l'ONH.
      NOTA: Usa la vite del traslatore Y per spostare l'ONH su e giù sul pannello di destra, se necessario. La posizione può essere modificata in qualsiasi momento tra una scansione e l'altra.

3. Imaging SD-OCT dell'ONH e della retina

1. Una volta soddisfatti delle regolazioni, fare clic su "Avvia istantanea" per avviare la scansione SD-OCT.
   1. Se non è necessario un imaging 3D, deselezionare l'opzione OCU.
2. Salva la scansione e il referto.
3. Procedi con le scansioni successive.
4. Per visualizzare il secondo occhio, dopo aver ritirato l'obiettivo, ruotare la cassetta di conseguenza e ripetere i passaggi 2.6 - 3.3.

4. Completamento dell'acquisizione

1. Quando l'acquisizione è completa, rimuovere il mouse dalla cassetta, applicare il gel oftalmico con ipromellosa allo 0,3% su ciascun occhio e posizionare il mouse su una piastra riscaldante per svegliarsi.
2. Dopo l'ultima acquisizione, chiudere il software e spegnere il computer e la macchina OCT (pulsante di alimentazione).
3. Pulire la cassetta con disinfettante.

5. Analisi

1. Per la misurazione dello spessore dello strato retinico, utilizzare il software di segmentazione automatizzata fornito dal produttore.
   1. Fare clic su "Paziente", scegliere l'"Esame" desiderato dall'elenco e fare clic sull'opzione "Rivedi esame".
   2. Caricare i dati OCT desiderati sul software OCT facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della cartella nella scansione desiderata.
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul B-scan; configurare i calibri abilitando fino a 10 calibri di misura; e inserisci i loro nomi, angoli e colori.
   4. Scegliere il calibro desiderato cliccando con il tasto destro del mouse sul B-scan; Posizionarlo di conseguenza sulla retina per la misurazione.
      NOTA: Per le scansioni centrate sull'ONH, posizionare 5 calibri su ciascun lato di esso, equidistanti l'uno dall'altro. Per l'analisi peripapillare, assicurarsi che il calibro non sia posizionato troppo lontano dall'ONH. Per la scansione radiale, analizzare 10 immagini per scansione scelte dal software OCT. I loro numeri possono essere trovati nella cartella "Rapporti".
   5. Salvare i risultati per l'analisi in un programma software per fogli di calcolo facendo clic con il pulsante destro del mouse sul B-scan e facendo clic su "Salva risultati".
      NOTA: I risultati possono essere trovati nella stessa cartella dei dati di scansione.
2. In alternativa, utilizzare la macro calibro fatta in casa, "MRI Retina Tool", sviluppata per un programma di elaborazione delle immagini open source (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Assicurarsi che le macro "MRI Retina Tool" e "Modify Polygon Section Tool" siano attive. Carica l'immagine. Fare clic sul pulsante m per avviare la misurazione.
      NOTA: La macro crea automaticamente una cassetta di misura lunga 0,2 mm su entrambi i lati dell'ONH. Ogni cassetta contiene 5 punti di misurazione che funzionano come calibri. La loro posizione laterale è immutabile ed è personalizzata per la peripapilla nelle scansioni radiali. La posizione orizzontale delle cassette è predefinita per misurare lo spessore RNFL/GCL, ma è facilmente modificabile per misurare lo strato complesso GC. Se la qualità della scansione è scarsa, è necessario regolare la posizione orizzontale o escludere l'immagine dall'analisi.
   2. Per la regolazione orizzontale, fare clic sul pulsante e. Nella finestra "ROI Manager" appena aperta, scegli la prima cassetta.
   3. Fare clic sul pulsante poligono blu e regolare la posizione della prima cassetta facendo clic sui bordi del livello misurato nell'immagine.
   4. Ripetere l'operazione per la seconda cassetta scegliendola prima nella finestra "ROI Manager" e poi cliccando sull'immagine appropriata. Fare clic sul pulsante r per rimisurare. Visualizza i risultati nella finestra "Misure".
      NOTA: I risultati possono essere copiati in un programma software per fogli di calcolo in qualsiasi momento. Contengono i seguenti valori per la cassetta destra (r), la cassetta sinistra (l) e il totale: Intden - densità integrata all'interno della cassetta; Area: area della misura, in mm2; Len: lunghezza della pinza all'interno della cassetta, in mm; Media: intensità media del segnale all'interno della cassetta; e Std: errore standard dell'intensità media del segnale.
   5. Procedi con l'immagine successiva.
   6. Analizza ulteriormente i dati in un programma software per fogli di calcolo.
      NOTA: Per trovare lo spessore medio dello strato, prendere i dieci valori Len.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti topi Opa1delTTAG mouseIstituto per le Neuroscienze di Montpellier, INSERM UMR 1051, Francia-Topi knock-in Opa1 portatori della mutazione c.2708_2711delTTAG OPA1 su sfondo C57Bl6/JEquipment EnVisu R2200 SD-OCT Imaging SystemBioptigen, Leica Microsystems, Germania-Sistema di tomografia a coerenza ottica del dominio spettraleSoftware del sistema di imaging EnVisu R2200 SD-OCTBioptigen, Leica Microsystems, Germania-Software per l'acquisizione e l'analisi OCTImageJ 1.48vWayne Rasband, National Institutes of Health, USA-<td style='colore-sfondo:#ffffff; colore:#1a202c; dimensione del carattere: 10pt; trabocco:nascosto; imbottitura:0px 3px; allineamento verticale:in basso; spazio-bianco:normale; ritorno a capo: spezzare la parola; strategia-avvolgere:4;' >Software per l'analisi, richiede il download e l'installazione di due macro hommade: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_ToolPiastra riscaldante autoregolanteBioseb, FranciaBIO-062Protezione contro l'ipotermiaSupplies Tamponi di garza 3"x3"Curad, USACUR20434ERBProtezione contro l'ipotermiaapplicatore di punta in cotone a doppia estremitàEssenza della bellezza, CVS Health Corporation, USA-Applicazione gelCotton TwistsCentraVet, FranciaT.7979C.CSPosizionamento del mouseReagenti e Farmaci Néosynéphrine Faure 10%Laboratoires Europhtha, Monaco-Dilatazione dell'occhioMydriaticum 0.5%Laboratoires Théa, Francia3397908Dilatazione dell'occhioCebesine 0.4%Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, Francia3192342Anestesia localeImalgene 1000Merial, Francia/CentraVet, FranciaIMA004Anestesia generaleRompunBayer Healthcare, Germania/CentraVet, FranciaROM001Anestesia generale, analgesia, rilassamento muscolareNaCl 0,9%Laboratoire Osalia, Francia103697114Siero fisiologicoSystene UltraAlcon, Novartis, USA-Idratazione degli occhiGenTeal'<td style='colore di sfondo:#ffffff;colore:#1a202c;dimensione-carattere:10pt;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento verticale:fondo;spazio-bianco:normale;word-wrap:break-word;strategia-wrap:4;'>Alcon, Novartis, USA-Gel oftalmico per minimizzare la rifrazione della luce e le opacitàAniospray Surf 29Laboratoires Anios, Francia59844Disinfettante