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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Imaging time-lapse
- Setup del microscopio
- Impostare una camera climatica posizionata sul tavolino di un microscopio confocale invertito a 37 °C e 5% di atmosfera di anidride carbonica. Utilizzare un rivelatore ibrido per ridurre l'intensità del laser e migliorare la vitalità cellulare. Per un'analisi dettagliata, utilizzare un obiettivo a secco 40X a distanza di lavoro extra lunga con un'apertura numerica di 0,6 o superiore.
Nota: Tutti i componenti del microscopio devono essere preriscaldati a 37 °C per 2 - 3 ore prima dell'imaging per fornire una messa a fuoco stabile durante il processo di imaging.
- Imaging a fette
- Seleziona una fetta di cervello per l'imaging dalla piastra a 6 pozzetti contenente gli inserti della membrana utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.
Attenzione: Evitare il tempo di esposizione prolungato alla luce ultravioletta in quanto ciò potrebbe causare fotodanni cellulari.
NOTA: Seleziona una fetta con singoli neuroni luminosi nella SVZ superiore (zona subventricolare) che migrano radialmente verso la superficie pial della fetta. I processi fluorescenti fini delle cellule gliali radiali che si estendono sull'intera CP (piastra corticale) indicano un'impalcatura gliale radiale intatta, che viene utilizzata dai neuroni corticali che migrano radialmente. - Trasferire l'inserto della membrana con la fetta, che è stata selezionata per l'imaging time-lapse, in una piastra con fondo di vetro di 50 mm di diametro contenente 2 ml di terreno di coltura per fette con l'aiuto di una pinza. Posizionare il piatto nella camera climatica del microscopio confocale.
- Impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel e aumentare la velocità di scansione da 400 Hz a 700 Hz per aumentare la frequenza dei fotogrammi da circa 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo, rispettivamente. Utilizzare non più di due volte la media. Definisci uno z-stack attraverso la regione elettroporata (di solito 400-100 μm) con una dimensione del passo di 1,5 μm. Collettivamente, queste impostazioni consentono una risoluzione e una luminosità sufficienti dell'immagine, mantenendo al contempo basso il fotodanneggiamento durante l'acquisizione. Inizia la serie di time-lapse prendendo uno z-stack ogni 30 minuti.
NOTA: L'esposizione prolungata della fetta alla luce laser indurrà fotodanneggiamento riducendo la vitalità delle cellule. Regolare di conseguenza il tempo di esposizione alla luce laser. - Analizza le serie time-lapse utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente.