Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Abstract

Source: Morsch, M., et. al., Triggering Cell Stress and Death utilizzando la microscopia confocale laser UV convenzionale. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, esploriamo la tecnica dell'ablazione laser UV ad alta intensità per indirizzare e studiare con precisione i singoli neuroni nel pesce zebra transgenico. Dimostriamo come preparare, immobilizzare e visualizzare le risposte neuronali, evidenziando le dinamiche cellulari della lesione e del recupero.

Protocollo

1. Preparare le soluzioni per l'inclusione del pesce zebra nell'agarosio.
   1. Preparare una soluzione per anestesia aggiungendo 4 g/L di MS222 (soluzione madre di tricaina, pH 7,0) goccia per goccia in una capsula di Petri contenente acqua d'uovo. Una dose di 50 mg/L è un punto di partenza raccomandato (Figura 1A).
   2. Preparare una scorta di agarosio a basso punto di fusione (0,8 - 1,5%) in acqua d'uovo e aliquotarla in provette da microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere un'aliquota in un blocco termico preriscaldato (38 - 40 °C) e lasciarla equilibrare alla temperatura impostata (~ 30 min; Figura 1B).
   3. Opzionale: per l'imaging a lungo termine (> 4 ore), preparare un piccolo cerchio di agarosio all'interno della piastra di Petri con fondo di vetro da 35 mm e lasciarlo solidificare.
      NOTA: Questo passo in più è stato efficace nell'evitare qualsiasi movimento dell'intera goccia di agarosio con il pesce zebra per periodi di tempo più lunghi.
      1. Per fare ciò, posizionare ~ 300 μL di agarosio lungo il cerchio interno del piatto con fondo di vetro per preparare un cerchio a forma di ciambella con una piccola apertura al centro in cui posizionare il pesce (passaggio 1.5.3).
2. Montare il pesce zebra nell'agarosio per la microscopia.
   1. Selezionare 1 - 3 dei pesci pre-selezionati per l'ablazione e anestetizzare le larve trasferendole (utilizzando una pipetta di trasferimento) in un piatto con la soluzione per anestesia (passaggio 1.4.1; Figura 1C; circa 5 minuti).
      NOTA: I pesci vengono anestetizzati quando mostrano un movimento opercolare superficiale e una frequenza cardiaca ridotta e non mostrano più una risposta di fuga evocata dal tocco (TEER; incapacità di nuotare via dopo aver toccato delicatamente la coda con una spazzola). Garantire un'anestesia adeguata per il trattamento etico dei pesci e per prevenire contrazioni durante il trasferimento nell'agarosio o l'esposizione a luce fluorescente.
   2. Dopo che l'anestesia è stata confermata, aspirare una larva utilizzando una pipetta regolabile (con una punta tagliata da 200 μL impostata su ~ 30 μL) e lasciarla affondare sul fondo della punta. Trasferire la larva nell'agarosio preriscaldato (passaggio 1.4.2) rilasciando una goccia del liquido con la larva nell'agarosio (cercare di ridurre al minimo la quantità di acqua d'uovo che entra nell'agarosio; Figura 1D).
   3. Aspirare il pesce circondato dall'agarosio. Erogarlo rapidamente nella pirofila da 35 mm con fondo di vetro precedentemente preparata.
   4. Utilizzare un microscopio da dissezione e un pennello standard (fodera lunga, misura 1) per posizionare l'animale all'interno dell'agarosio sul lato (testa a sinistra) in modo che il corpo e la coda siano piatti (Figura 1E). Se si lavora con più pesci, allineare tutti i pesci nel piatto in modo che siano facilmente individuabili utilizzando il microscopio confocale in un secondo momento.
      NOTA: Eseguire rapidamente questa procedura di posizionamento e allineamento (potrebbe richiedere un po' di pratica, poiché l'agarosio inizia a solidificarsi immediatamente dopo l'esposizione a temperature più fredde).
   5. Lasciare il pesce incorporato nell'agarosio per 10-15 minuti fino a quando l'agarosio non si sarà solidificato. Rabboccare con cura la capsula di Petri da 35 mm con ~ 2 ml di acqua d'uovo contenente tricaina (Figura 1F).

2. Impostare il microscopio confocale e i parametri di imaging

1. Posizionare la capsula di Petri con la larva incorporata sul tavolino del microscopio confocale e concentrarsi sul lato dorsale del midollo spinale dell'animale (utilizzando il campo chiaro). Esaminare l'animale con l'ingrandimento appropriato (40X) e l'impostazione fluorescente e visualizzare la struttura di interesse (ad esempio, intensità di fluorescenza dei neuroni marcati o movimento microgliale) per confermare che tutti i parametri di imaging siano necessari per la successiva ablazione (Figura 2). Utilizziamo abitualmente l'obiettivo 40X per eseguire i nostri studi time lapse.
2. Opzionale: per eseguire uno studio time-lapse per diverse ore, è consigliabile registrare uno o più punti temporali prima dell'ablazione per stabilire la risposta fisiologica imperturbata della cellula e del suo ambiente ( ad esempio, movimento microgliale per stabilire la velocità e la motilità di base).
3. Determinare lo spessore della struttura di interesse per l'ablazione laser UV.
   1. Utilizzando l'unità z, verificare la parte superiore e inferiore della struttura di interesse (ad esempio, la cella soma) mettendo a fuoco manualmente su e giù. Annota il piano z che verrà ablato (ad esempio, il centro della cella).
      NOTA: Per esperienza, questo metodo è stato più efficace prendendo di mira i neuroni del midollo spinale che sono stati marcati in modo brillante (un alto rapporto segnale-rumore che consente una facile visualizzazione time-lapse dopo l'ablazione; ad esempio, Figura 4) e ablando il centro del soma cellulare. La fluorescenza del nucleo cellulare può essere vantaggiosa per garantire un corretto targeting e un'elevata efficienza di ablazione.

3. Eseguire l'ablazione laser mirata di singole cellule nel midollo spinale del pesce zebra

NOTA: Per questo approccio di ablazione e visualizzazione, è stato utilizzato un microscopio confocale (Leica SP5). La procedura di ablazione con un diodo da 405 nm per la distruzione specifica della cellula è descritta in dettaglio secondo il software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Tuttavia, qualsiasi microscopio confocale convenzionale dotato di un laser a 405 nm e di un FRAP (recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento) o di un modulo bleach consentirà l'esecuzione delle stesse manipolazioni cellulari, ma potenzialmente con impostazioni, parametri e nomi leggermente diversi.

1. Avviare la procedura guidata FRAP facendo clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu del software (Figura 3A, 1 e 2). Osservare una nuova finestra con diversi passaggi che consente l'impostazione dei parametri specifici per l'ablazione laser (Figura 3B, 3).
2. Determinare i parametri dell'immagine per l'approccio di ablazione selezionando il formato, la velocità di scansione (Figura 3B, 4) e la media (Figura 3B, 5). Un formato immagine di 1.024 x 1.024 a una velocità di scansione di 400 Hz e una media di linee di 4 era il più applicabile.
   NOTA: Non c'è generalmente bisogno di cambiare la rivelazione spettrale (come i parametri di eccitazione o di emissione), poiché sono stati determinati nell'acquisizione precedente.
   1. Se il piano z per l'ablazione non è già stato selezionato (come descritto nel passaggio 2.4.), premere il pulsante "Live" e mettere a fuoco il campione fino a quando la struttura fluorescente o il piano z desiderato che verrà ablato non è a fuoco.
3. Una volta impostati i parametri generali dell'immagine, accedere al passaggio "Bleach" (Figura 3C, 6) per controllare i componenti specifici dell'ablazione.
   NOTA: Una combinazione dell'intensità del laser (Figura 3C, 8), la velocità di scansione e la media che è stata impostata nel passaggio 3.2 (Figura 3B, 4 e 5), nonché il numero di ripetizioni che verranno impostate nel passaggio 3.5 (Figura 3E, 12), determinerà il tempo di permanenza complessivo del laser UV al ROI e, quindi, l'efficienza di sbiancamento.
   1. Attivare il laser a 405 nm attivandolo per la procedura di sbiancamento (Figura 3C, 8).
      NOTA: La maggior parte del successo con le impostazioni di cui sopra è stata ottenuta con intensità laser di 405 nm tra il 60 e l'80% nella nostra configurazione sperimentale. Tieni presente che questa potenza del laser è specifica dello strumento e differirà per ogni configurazione confocale.
   2. Utilizzare l'opzione "zoom in" (Figura 3C, 7) per massimizzare l'intensità dello sbiancamento al ROI selezionato riducendo il campo di scansione, massimizzando così il tempo di permanenza. In alternativa, utilizzare l'opzione "Bleach point" del software scelto per questo processo.
4. Selezionare una o più ROI (Figura 3D, 10) utilizzando uno qualsiasi degli strumenti di disegno nella finestra di acquisizione dell'immagine (Figura 3D, 9). Individua la collinetta dell'assone, ad esempio, con lo strumento di disegno circolare di circa 4 - 8 μm.
   NOTA: L'area di ablazione è regolabile da un singolo pixel a un'area più ampia, a seconda dell'applicazione.
5. Dopo aver stabilito il ROI, selezionare il pulsante "Andamento temporale" (Figura 3E, 11) e confermare il numero di cicli in cui le ROI verranno scansionate/ablate (Figura 3E, 12). Scegli i fotogrammi "Pre-Bleach" e "Post-Bleach" a piacere per consentire una panoramica dell'intera immagine appena prima e subito dopo il processo di sbiancamento.
6. Dopo aver stabilito tutti i parametri di ablazione necessari, premere "Esegui esperimento" (Figura 3E, 13) e monitorare l'efficienza dell'ablazione.
   NOTA: Nella nostra configurazione FRAP, verrà scattata una singola immagine prima e dopo il ciclo FRAP con l'eccitazione laser appropriata (ad esempio, eccitazione a 488 nm per cellule che esprimono EGFP). Queste immagini pre e post ablazione consentono di valutare rapidamente la soddisfazione del ROI e l'efficacia dei parametri di ablazione scelti.
7. Ripetere il processo regolando l'intensità del laser (Figura 3C, 8), la velocità di scansione e la media (Figura 3B, 4 e 5) e ripetizioni (Figura 3E, 12) nel caso in cui il ROI selezionato mostri ancora un'elevata intensità di fluorescenza dopo il completamento del ciclo FRAP.

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