Imaging TSPO-PET/TC per rilevare la formazione di infarti in un modello murino di ictus ischemico

Abstract

Fonte: Chaney, A. M., et.al. Imaging PET della neuroinfiammazione utilizzando [¹¹C]DPA-713 in un modello murino di ictus ischemico. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica per l'imaging in vivo della neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico utilizzando un radiotracciante specifico per TSPO. Dopo l'iniezione, il radiotracciante si lega al TSPO, una proteina situata sulla membrana mitocondriale esterna e sovraespressa nelle cellule immunitarie attivate. Uno scanner PET/CT rileva la distribuzione del radiotracciante e genera un'immagine co-registrata con i dati TC, consentendo una localizzazione precisa delle regioni neuroinfiammatorie nel cervello.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Calibrazioni PET/CT e impostazione del flusso di lavoro (6 giorni dopo l'intervento chirurgico dMCAO)

1. Creare un flusso di lavoro di imaging nel software operativo dello scanner per includere un'acquisizione dell'attenuazione CT, un'acquisizione PET dinamica C-11 di 60 minuti (discriminazione del livello 350 - 650 keV, finestra di coincidenza 3,438 ns), istogramma (20 fotogrammi: 5 x 15 sec, 4 x 1 min, 11 x 5 min; con correzione del tempo morto) e una ricostruzione 3DOSEM-OP (2 iterazioni, 18 sottoset) per creare immagini 128 x 128 x 159 con dimensioni voxel di 0,776 x 0,776 x 0,96 mm.
2. Eseguire il condizionamento della sorgente di raggi X tramite il pannello di calibrazione CT situato nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia. Questa calibrazione deve essere eseguita settimanalmente o prima della scansione se il sistema non è stato utilizzato nelle ultime 48 ore.
3. Eseguire le calibrazioni scuro/chiaro (D/L) e l'offset centrale (C/O).
   1. Premere il pulsante di calibrazione CT (X) in alto a sinistra dell'interfaccia.
   2. Selezionare D/L e C/O per il file CT che si intende eseguire, rimuovere il letto dal gantry ed eseguire la calibrazione D/L.
   3. Inserire il basamento dello strumento di calibrazione nello scanner ed eseguire la calibrazione C/O, assicurandosi di cambiare la selezione sull'interfaccia su "strumento di calibrazione" invece di "tavolozza da 70 mm".
4. Rimuovere lo strumento di calibrazione e ripristinare il letto in PET standard, assicurandosi di modificare la selezione sull'interfaccia su "tavolozza da 70 mm".
5. Fissare un letto di imaging a 4 topi sulla piattaforma dello scanner utilizzando del nastro adesivo e collegare il tubo per anestesia (Figura 1A). Assicurarsi che l'isoflurano scorra attraverso i tubi e che non vi siano attorcigliamenti.
6. Spingere il letto in avanti in modo che si trovi al centro del campo visivo (FOV), chiudere la porta CT e ottenere una vista esplorativa del CT per assicurarsi che il letto sia nella posizione corretta.
7. Eseguire una calibrazione "standard" dello scanner PET/CT utilizzando un fantoccio prodotto internamente contenente una dose nota di soluzione di C-11 come sorgente di radiazioni.
   1. Preparare una siringa da 20 ml riempita con la dose di tracciante equivalente a quella somministrata a un topo (~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq di tracciante C-11 diluito in soluzione fisiologica).
   2. Registrare l'attività nello standard utilizzando un calibratore di dose e annotare il tempo di misurazione.
   3. Eseguire una scansione PET/CT dello standard utilizzando gli stessi parametri che verranno utilizzati per l'imaging dei topi (come descritto sopra). Eseguire questa operazione settimanalmente per creare un fattore di correzione per lo scanner PET da applicare ai dati di imaging.

2. Configurazione dell'area di lavoro per l'imaging PET/CT

1. Creare un ambiente sterile utilizzando un disinfettante con virucida (vedere {Tabella dei materiali) e posizionando un'imbottitura assorbente protettiva su tutte le superfici.
2. Assicurarsi che i serbatoi di isoflurano e ossigeno siano adeguatamente riempiti.
3. Preparare i cateteri della vena caudale riempiendo una siringa da 1 ml (dotata di una punta dell'ago da 27,5 G) con cloruro di sodio allo 0,9% (soluzione fisiologica sterile) e lavandoli con un catetere a farfalla da 27,5 G e 24 cm. Tagliare le ali del catetere prima dell'incannulamento per assicurarsi che non ostruiscano la vista della vena caudale e per facilitare lo spostamento dei topi nello scanner senza spostare il catetere.
4. Assicurarsi che tutte le attrezzature essenziali siano disposte sul posto di lavoro, comprese le siringhe di ricambio "a filo" (riempite con soluzione fisiologica sterile), il lubrificante per gli occhi, i tamponi a base di etanolo, le lampade termiche, i cateteri preparati (pre-riempiti con soluzione fisiologica), il nastro chirurgico, la colla per tessuti, le siringhe da 0,5 ml, le forbici e un catetere più leggero per sigillare dopo il posizionamento riuscito nella vena caudale (Figura 1B).

3. Preparazione e incannulamento degli animali

1. Pesare i topi per determinare il volume massimo consentito per essere iniettato in ciascun topo (cioè volume di tracciante e qualsiasi soluzione salina somministrata non deve superare il 10% del peso corporeo).
2. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 3% e mantenerli all'1-2% (2 L/min 100% O₂).
3. Applicare il lubrificante per gli occhi su ciascun mouse e confermare l'anestesia tramite il riflesso del pedale (pizzicamento delle dita). Regolare i livelli di anestesia, se necessario.
4. Posizionare il mouse su un piano riscaldato dotato di un cono per erogare isoflurano all'1-2% (2 L/min 100% O₂).
5. Mentre il topo è anestetizzato, eseguire l'incannulamento della vena caudale utilizzando il seguente protocollo:
   1. Posizionare il topo su un lato per esporre una delle vene laterali, mentre la testa rimane nel cono del naso.
   2. Scaldare la coda utilizzando una lampada termica, facendo attenzione a non surriscaldarla o bruciarla, e tamponarla con una salvietta imbevuta di alcol per dilatare la vena e sterilizzare il sito di iniezione.
   3. Tenere l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto e allinearlo con la vena ad angolo acuto.
   4. Applicare una leggera pressione per perforare la pelle e livellare l'ago in modo che sia in linea con la vena.
   5. Spingere delicatamente in avanti di alcuni millimetri oltre lo smusso in modo che l'ago entri nella vena.
   6. Verificare che il catetere sia inserito somministrando una piccola dose (10-20 μL) di soluzione fisiologica. La soluzione salina dovrebbe lasciare la siringa senza intoppi e la vena dovrebbe schiarirsi. Se si osserva una resistenza o una contropressione, è probabile che il catetere non sia nella vena ed è consigliabile ritentare l'incannulamento. Se si osserva coagulazione, utilizzare l'eparina (1.000 unità di eparina per mL di soluzione fisiologica) per l'impostazione dell'incannulamento e il lavaggio.
      NOTA: Abbiamo valutato l'incannulamento con e senza eparina nel ceppo di topo di interesse, e poiché non è stata osservata alcuna coagulazione, la soluzione salina da sola è stata utilizzata per le incannulazioni.
   7. Fissare il catetere alla coda utilizzando una piccola goccia di colla per tessuti, seguita da nastro chirurgico, per garantire che il catetere rimanga immobile durante il trasferimento dei topi allo scanner.
   8. Rimuovere la siringa di lavaggio dall'estremità del catetere e sigillare l'estremità con un accendino, assicurandosi che il ricercatore non sia vicino a isoflurano o etanolo.
   9. Ripetere per altri 3 topi in modo che tutti e 4 i topi da scansionare siano incannulati e preparati.
6. Attivare il flusso di anestesia (2,5% isoflurano, 2 L/minuto 100% O₂) collegato alla PET/CT e posizionare con cura i topi proni nel letto dello scanner, assicurandosi che i cateteri rimangano in posizione e che la testa di ciascun topo sia diritta e sicura all'interno del cono del naso. Fissare la testa e il corpo di ciascun topo al letto con nastro chirurgico morbido, assicurandosi che la respirazione non sia limitata dal posizionamento del nastro. Registra la posizione di ciascun mouse per consentire la corretta posizione e l'allocazione del gruppo per l'analisi delle immagini.
7. Mantieni i mouse riscaldati durante la procedura (ad esempio, utilizzando una lampada termica o un sistema di pompa ad aria calda per garantire che i topi siano mantenuti caldi senza surriscaldarsi). Monitorare la frequenza respiratoria di tutti i topi, sia visivamente se si utilizza un portale aperto che attraverso un sistema di monitoraggio remoto che utilizza cuscinetti respiratori, e modificare i livelli di anestesia secondo necessità.

4. Acquisizione TC

1. Una volta che gli animali sono al sicuro nel letto e la respirazione è stabile, accendi il mirino laser e sposta il letto di scansione in modo che si allineino con il cervello di tutti e quattro i topi. Spostare il piano dello scanner nella posizione di acquisizione (posizione 3) con il cervello dei topi il più vicino possibile al centro del campo visivo.
2. Acquisisci un'immagine scout view dei mouse per verificarne la posizione (usa un FOV di 200 mm) e regola la posizione trascinando la casella FOV sull'interfaccia, se necessario. Fare clic su "Avvia flusso di lavoro" nel software dello scanner per avviare la scansione TC, assicurandosi di selezionare "visualizza messaggi interattivi per l'utente" in modo che la scansione PET possa essere avviata manualmente prima dell'iniezione del tracciante.

5. [¹¹C]DPA-713 Preparazione della dose

1. Sintetizza [¹¹C]DPA-713, assicurarsi di indossare DPI (dispositivi di protezione individuale) appropriati per la manipolazione della radioattività, tra cui camice da laboratorio, guanti e dosimetri personali per le dita e il corpo. Assicurati di cambiare regolarmente i guanti per prevenire la contaminazione radioattiva e di aumentare la distanza dalla sorgente radioattiva quando possibile.
2. Utilizzare una pinza per trasferire con cura la fiala del radiotracciante dietro uno schermo di piombo.
3. Preparare siringhe da 0,5 ml per ciascun topo contenenti circa 250-350 μCi/9-13 MBq in un volume di 100-200 μL per garantire una dose adeguata per una scansione PET dinamica di 60 minuti (la dose somministrata deve essere determinata considerando l'emivita dell'isotopo e la linea temporale del disegno dello studio, con il volume che dipende dal peso del topo).
4. Misurare l'attività utilizzando un calibratore di dose impostato su C-11, situato nelle immediate vicinanze del sito di incannulamento, e registrare i tempi di misurazione e iniezione per consentire la correzione del decadimento. Prelevare le dosi appena prima della fine della TC per limitare il decadimento e garantire che il livello di radioattività desiderato venga iniettato in ciascun topo.
5. Verificare che non vi siano bolle d'aria nella siringa dosatrice prima di misurare l'attività e iniettare in ciascun topo.

6. Acquisizione PET

1. Una volta che i topi avanzano automaticamente da CT a PET, impostare il retro dello scanner per [¹¹C]DPA-713 iniezione (Figura 1C). Posiziona un'imbottitura assorbente protettiva su una sporgenza e assicurati che le forbici e l'accendino siano a portata di mano.
2. Tagliare il tubo sigillato del catetere con le forbici, controllare che le linee del catetere siano prive di bolle e confermare che la cannula sia ancora all'interno della vena eseguendo un lavaggio con soluzione salina da 10-20 μl. Caricare le siringhe della dose misurata dal passaggio 5.4 in ciascuno dei 4 cateteri, tenendo traccia della dose somministrata a ciascun topo.
3. Fare clic su "OK" quando la scansione PET è pronta per l'avvio e contemporaneamente si avvia un timer di 10 secondi. Avere due ricercatori sul retro dello scanner con le siringhe dosatrici in mano, per iniettare tutti e 4 i topi contemporaneamente quando il timer raggiunge lo zero. Lavare ogni catetere con 50-100 μL di soluzione fisiologica (a seconda della lunghezza del tubo del catetere — cioè il volume morto) per assicurarsi che l'intera dose entri nella vena di coda e richiudere nuovamente il tubo con un accendino.
4. Misurare le siringhe dosatorie utilizzando un calibratore di dose per ottenere un valore di radioattività residua (eventuale tracciante rimasto nella siringa). Prendere nota dei valori e dell'ora in cui vengono registrati.
5. Una volta completata la scansione, riporta la cuccia alla posizione originale utilizzando il pulsante orizzontale "home" all'interno del pannello di controllo del movimento. Rimuovere i mouse dallo scanner e rimuovere con cautela il catetere. Applicare delicatamente una pressione sul sito di incannulamento per evitare un sanguinamento eccessivo.
6. Misurare l'attività residua nel catetere utilizzando un calibratore di dose.
7. Se i topi devono essere recuperati, assicurati che ciò avvenga in un ambiente caldo (ad esempio, in una scatola con un cuscinetto riscaldato sotto o contenente un guanto riempito con acqua calda) per facilitare il recupero. Se si prevede di sopprimere i topi, posizionare i topi in una camera di induzione contenente isoflurano in modo che rimangano anestetizzati prima dell'eutanasia tramite perfusione.
8. Per ricostruire i dati, aprire il software di gestione della post-elaborazione (vedere Table of Materials), che ricostruirà automaticamente ogni scansione utilizzando i dati dell'istogramma generati dal file lst.

7. Analisi dinamica delle immagini PET

1. Apri il software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali) e fai clic sull'icona "apri dati" per caricare l'immagine CT (come fonte) e sull'icona "aggiungi dati" per caricare la PET dinamica (come riferimento).

2. Eseguire un controllo visivo della qualità dei dati tramite l'operatore delle serie temporali nel menu a discesa: selezionare riferimento ("ref") e "global" e applicare un minimo e un massimo appropriati per la scala di colori. Visualizza i dati dinamici della PET fotogramma per fotogramma, verificando l'assorbimento della radioattività e controllando eventuali confusioni di movimento all'interno della scansione.

3. Crea un'immagine PET media utilizzando l'"operatore aritmetico".

1. Scegliere "media selezionata", deselezionare "ref" e assicurarsi che l'input 1 ("Inp1"), l'input 2 ("Inp2") e la stella di input ("Inp*" - include il resto dei fotogrammi PET nella scansione) siano selezionati per creare una media di tutti i frame PET.

2. Vai alla scheda "Gestione dati" (DM) e trascina l'immagine media fino alla posizione "input1" per scopi di visualizzazione. Ridistribuire la scala dei colori facendo clic sul calcolo automatico nello strumento "min-max".

4. Registrare il CT sul file PET medio utilizzando la funzione "3D automatico" nel menu a discesa "riorientamento/registrazione".

1. Selezionare "ref" e "Inp1", e scegliere la registrazione "rigida", "veloce", "Inp1 a Ref". Controllare visivamente la registrazione in tutte e 3 le dimensioni e regolare manualmente se necessario nella scheda "3D manuale" utilizzando le funzioni "traslazione" e "rotazione".

2. Una volta effettuata la registrazione, selezionare "Inp2" e "Inp*" e applicare a tutti i telai in PET cliccando sul segno di spunta. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui file CT e PET nel DM e salvarli come raw.

5. Ritaglia il cervello di un topo alla volta per l'analisi del cervello utilizzando la TC come guida: seleziona "ritaglio" dal menu a discesa e trascina i bordi dell'immagine per ritagliare la testa del topo sotto il tronco encefalico. Riorientare le immagini PET e TC utilizzando la funzione di "riorientamento 3D manuale" come descritto sopra, in modo che il cranio sia dritto in tutte le dimensioni.

6. Caricare l'immagine MR per quel mouse (in formato DICOM) utilizzando il pulsante "aggiungi dati" in alto a sinistra dell'interfaccia. Spostare la risonanza magnetica utilizzando il "riorientamento 3D manuale" e adattarla al cranio all'interno dell'immagine TC (assicurarsi che tutte le modalità siano nello stesso orientamento).

7. Disegna la ROI del tratto sull'immagine RM utilizzando lo "strumento ROI 3D".

1. Disattivare la visualizzazione PET deselezionandola all'interno della scheda del controller visivo (VC) e utilizzare solo la risonanza magnetica e la CT per disegnare il ROI.

2. Fare clic sul pulsante "aggiungi ROI" per creare un nuovo ROI e denominarlo "infarct". Seleziona lo "strumento spline", facendo clic con il pulsante sinistro del mouse per disegnare il bordo ROI e facendo clic con il pulsante destro del mouse per chiuderlo.

3. Ripeti tutte le sezioni che comprendono il tratto, assicurandoti di non catturare nessuno del cranio nella ROI, con la migliore pratica di lasciare uno spazio voxel tra il bordo del cranio e la ROI del tratto.

8. Generare un ROI controlaterale utilizzando il volume dell'infarto.

1. Crea un nuovo ROI ed etichettalo come "controlaterale". Fare clic con il pulsante destro del mouse su Infarct ROI e selezionare "esporta". Trascinare la ROI in posizione 2 ("Inp1").

2. Con solo "Inp1" selezionato, applicare un flip sinistro destro utilizzando la funzione "operatore" all'interno del menu "riorientamento/registrazione". Seleziona la casella "ROI", scegli "solo visualizzazione" e sposta manualmente la nuova ROI nella stessa regione sul lato controlaterale. Selezionare l'operatore "aritmetico" e applicare una moltiplicazione scalare di 2 alla nuova ROI, consentendo una quantificazione indipendente delle ROI.

3. Torna allo strumento ROI 3D. Vai alla scheda "esperto e sperimentale" e fai clic sul pulsante "importa ROI". Selezionare Inp1 dalla finestra di dialogo per caricare il nuovo volume come ROI controlaterale.

9. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine PET media, scaricarla e riaccendere l'PET. Genera i risultati quantitativi dell'assorbimento utilizzando l'icona "esporta risultati" all'interno dello strumento ROI 3D.

10. Se lo si desidera, è possibile eseguire un'analisi aggiuntiva dello split brain (ad esempio, la generazione automatizzata del ROI delle regioni dell'emisfero destro rispetto a quello sinistro utilizzando un modulo plug-in 3D dell'atlante cerebrale del mouse per il software Vivoquant).

1. Ricaricare le immagini PET/CT registrate.

2. Importa l'atlante del cervello del mouse facendo clic sul menu "Moduli avanzati" e selezionando lo strumento Atlante del cervello 3D. Seleziona "tutte le regioni sinistra/destra" nelle "impostazioni avanzate" e fai clic su "Esegui" per importare l'atlante 3D.

3. Adatta manualmente l'atlante all'interno del cervello usando il teschio come bordo.

4. Eseguire nuovamente l'atlante assicurandosi che l'opzione "importa ROI 3D" sia selezionata per generare un foglio di calcolo dei risultati per tutte le 14 ROI dell'emisfero sinistro e destro (midollo, cervelletto, mesencefalo, ponte, corteccia, ippocampo, talamo, ipotalamo, striato, pallido, bulbi olfattivi, corpo calloso e sostanza bianca).

11. Quantificare l'assorbimento del tracciante nella milza utilizzando il software operativo dello scanner (vedi Tabella dei materiali).

1. Caricare i file immagine PET e CT evidenziandoli nel database e cliccando su "analisi generale".

2. Fare clic sulla scheda di registrazione e co-registrare le immagini PET e CT facendo clic sull'icona "registrazione rigida".

3. Fare clic sulla scheda Quantificazione ROI, fare clic sull'icona "crea ROI" e denominarla milza.

4. Scegli lo strumento "sfera" per disegnare le ROI della milza utilizzando il file CT come riferimento, assicurandoti che non vi siano sovrapposizioni con la captazione renale (utilizzando l'immagine PET e il segnale per evitare la fuoriuscita dai reni).

5. Modifica le ROI per mantenere volumi di ROI coerenti tra gli animali.

12. Calcolare un valore di correzione standard per la normalizzazione dell'assorbimento.

1. Caricare i dati PET/CT dalla scansione standard e creare una ROI del cilindro che comprenda la siringa da 20 ml utilizzando lo strumento "ROI 3D manuale".

2. Ottenere il livello di radioattività contenuto nello standard utilizzando l'icona del foglio di calcolo.

3. Utilizzare questo risultato nCi/cc e la radioattività originale registrata per lo standard (ad esempio, la misurazione del calibratore di dose dello standard in nCi/cc) per creare un fattore di correzione per i valori di assorbimento della PET. Cioè, dividere la radioattività dello standard registrato dal calibratore di dose per la radioattività calcolata dall'immagine PET dello standard.

13. Utilizzare le attività di dose e il tempo delle misurazioni per decadere correttamente al momento dell'acquisizione della PET per tutti i topi (cioè calcolare l'attività della dose all'inizio della scansione PET).

14. Ripetere per i valori residui e sottrarre dalla dose corretta per il decadimento per calcolare l'esatta attività ricevuta da ciascun animale.

15. Dopo aver applicato questa correzione del decadimento, applicare anche la correzione standard per assicurarsi che i dati siano al giusto livello di attività. Assicurarsi che queste correzioni vengano applicate ai risultati del ROI disegnati manualmente e ai dati del ROI dell'atlante cerebrale rilevanti per le regioni cerebrali per la posizione del dMCAO (ad esempio, corteccia, ippocampo e striato).

16. Calcolare la %ID/g per tutte le ROI utilizzando la seguente equazione: %ID/g = (ROI radioattività in nCi/cc / dose corretta per il decadimento ricevuta in nCi/cc) x100. Traccia la %ID/g in funzione del tempo utilizzando un software grafico per generare curve di attività temporale per ogni ROI.

17. Utilizza il software scanner per la visualizzazione finale dell'immagine e la generazione di figure. Normalizza le immagini in base alla dose corretta per il decadimento ricevuta da ciascun mouse al momento della scansione, assicurandoti che tutte le immagini siano sulla stessa scala %ID/g.

NOTA: Questo è necessario per consentire un confronto accurato di immagini di topi diversi e/o immagini di studi eseguiti in giorni diversi.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Scanner PET/CT Inveon	Siemens	Versione 4.2
software VivoQuant	InVicro	Versione 2.5	Software di analisi delle immagini
Software Inveon Research Workspace	Siemens	Versione 4.2	Software operativo dello scanner. Include microQView, il software di gestione della post-elaborazione
Calibratore di dose	Capintech		CRC-15 PET
Imager al fosforo Typhoon 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Cateteri a farfalla	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G
1 mL siringhe	BD
Siringhe da insulina	BD	329461	0.5 mL siringhe da insulina con ago
20 mL siringa	VWR	BD302831	BD Siringa Slip Tip Graduato
Colla tissutale	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Lampada termica	Fluker	27002	5.5" lampada termica per rettili con morsetto e interruttore
0.9% soluzione salina sterile	Pfizer	00409-4888-10	0.9% cloruro di sodio per iniezione, 10 mL
Fogli assorbenti Chux	ThermoFisher Scientific	1420662	Imbottitura assorbente usa e getta
Forbici dell'iride	World Precision Instruments	503708-12	11.5cm, dritto, confezione da 12
Nastro chirurgico	3M Durapore	1538-0	1/2"X10 yard rotolo, seta, ipoallergenico
Letto PET del topo	In house		4 mouse PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isotesia, anestetico per inalazione, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Gas compresso
Lubrificante per gli occhi	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubrificante Occhio Unguento, 1/8 oz

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