Monitoraggio morfologico e fisiologico degli sferoidi tumorali mediante tomografia a coerenza ottica

Abstract

Fonte: Huang, Y. et. al., Monitoraggio morfologico e fisiologico longitudinale di sferoidi tumorali tridimensionali mediante tomografia a coerenza ottica. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra l'uso della coerenza ottica tomografia (OCT) per monitorare gli sferoidi tumorali in una piastra multipozzetto acquisendo immagini in sezione trasversale ad alta risoluzione. Analizzando i riflessi di luce dalle strutture cellulari, OCT costruisce modelli 3D per valutare caratteristiche morfologiche come le dimensioni e la forma, distinguendo anche le cellule vitali da quelle non vitali in base ai cambiamenti di diffusione della luce nel tempo.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Ottenere linee cellulari da un fornitore qualificato.
   NOTA: Verificare che le cellule delle linee cellulari di interesse possano formare sferoidi nei terreni di coltura o con l'aiuto di un substrato (matrice di membrana basale come Matrigel). Esamina la letteratura o esegui un giro di pre-esperimento per un controllo.
2. Scongelare le celle congelate seguendo la procedura specifica fornita dal fornitore della linea cellulare. Una procedura generale può essere trovata altrove.
3. Coltura delle cellule per 1-2 passaggi in matracci di coltura da 25 cm². Le cellule sono quindi pronte per l'uso per la coltura cellulare 3D.
4. Monitorare quotidianamente lo stato di salute delle cellule e mantenerle in un incubatore in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità). Aggiornare il file multimediale in base alle esigenze.
   NOTA: Il terreno di coltura è costituito da Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) (4,5 g/L di glucosio), 1% di antibiotico-antimicotico e 10% di siero fetale bovino (FBS). Cellule di subcoltura prima che raggiungano la confluenza nel pallone di coltura. Seguire le linee guida per le colture cellulari fornite dal fornitore. Una procedura generale può essere trovata altrove.
5. Esecuzione di colture cellulari 3D in piastre multipozzetto in base al seguente protocollo generale.
   1. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone di coltura e lavarlo con soluzione fisiologica sterilizzata tamponata con fosfato (PBS, riscaldata a 37 °C).
   2. Risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di acido tripsina etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,5%) nel pallone per 3 minuti. Quindi, aggiungere terreni di coltura per diluire la tripsina.
   3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 500 x g e temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 4 mL di terreno di coltura preriscaldato. Pipettare una goccia del campione su un emocitometro per la conta cellulare per determinare la concentrazione cellulare. Diluire le cellule alla concentrazione appropriata per la semina (ad es. , 3.000 cellule/mL).
      NOTA: Ottimizza la concentrazione iniziale di cellule dello sferoide per ogni linea cellulare e ogni tipo di piastra multi-pozzetto (96 pozzetti, 384 pozzetti o 1536 pozzetti).
   5. Semina le cellule in una piastra multipozzetto a fondo tondo a bassissimo attacco (ULA). Aggiungere 200 μL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto a una concentrazione di 3.000 cellule/mL in modo che ogni pozzetto abbia circa 600 cellule.
   6. A temperatura ambiente (RT), centrifugare l'intera piastra utilizzando un adattatore per piastre per 7 minuti, subito dopo la semina, a una velocità di 350 x g o alla velocità più bassa disponibile.
      NOTA: La centrifuga aiuta a raccogliere le cellule al centro del pozzetto per facilitare la formazione di un singolo sferoide uniforme. La fase di centrifugazione viene eseguita una sola volta all'inizio per formare gli sferoidi tumorali. Non si ripeterà quando gli sferoidi tumorali inizieranno a crescere.
   7. Mantenere la piastra a più pozzetti a 37 °C e al 5% di CO₂ in un incubatore di coltura e aggiornare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
      NOTA: Il tempo di crescita può variare in base alle diverse condizioni di coltura 3D. Nel nostro studio, 3.000 cellule/mL vengono utilizzate per le linee cellulari U-87 MG e HCT 116 in piastre a 96 pozzetti, in modo che lo sferoide possa crescere fino a ~500 μm in 4-7 giorni per le cellule HCT 116. Sulla base del protocollo generale di coltura 3D, è consigliabile aggiungere supplementi di terreni e fattori di crescita per diversi modelli di sferoidi.
   8. Eseguire l'imaging con tomografia a coerenza ottica (OCT) degli sferoidi tumorali ogni 3-44 giorni per uno studio longitudinale della loro crescita.
      NOTA: I punti temporali raccomandati per l'imaging OCT sono il giorno 4, il giorno 7, il giorno 11, il giorno 14, il giorno 18 e il giorno 21.

2. Piattaforma di imaging OCT ad alto rendimento

NOTA: Vedere Figura 1 per i dettagli del sistema di imaging OCT personalizzato utilizzato in questo studio.

1. Scegliere una sorgente di luce a banda larga appropriata per il sistema OCT per l'imaging degli sferoidi tumorali.
   NOTA: Qui, un diodo superluminescente (SLD, Figura 1A, B) con una lunghezza d'onda centrale di ~1.320 nm e una larghezza di banda di 110 nm è stato utilizzato come sorgente luminosa a banda larga.
2. Costruire il braccio di riferimento e il braccio campione del sistema OCT seguendo gli schemi (vedere Figura 1A, B per i dettagli). La Tabella of Materials elenca i componenti ottici necessari per costruire il sistema OCT. Assicurarsi che le lunghezze del percorso ottico del braccio di riferimento e del braccio del campione corrispondano perfettamente.
3. Costruire lo spettrometro, includendo un collimatore, un reticolo, una lente F-theta e una fotocamera a scansione lineare (vedere Figura 1C per i dettagli del design dello spettrometro OCT. In alternativa, selezionare uno spettrometro commerciale che corrisponda alla lunghezza d'onda centrale della sorgente luminosa. Assicurarsi che lo spettrometro sia allineato correttamente per coprire l'intera larghezza di banda del laser, per ottenere un'elevata efficienza di raccolta dei fotoni e per fornire un lento lavaggio del modello di interferenza.
4. Caratterizzare le prestazioni del sistema OCT, incluse le seguenti metriche come la potenza del braccio del campione, la profondità totale dell'imaging, la sensibilità dipendente dalla profondità, la risoluzione assiale, la profondità di messa a fuoco e la risoluzione laterale. Posiziona un riflettore debole (ad esempio , uno specchio con un filtro a densità neutra) come campione per misurare la sensibilità dipendente dalla profondità, la risoluzione assiale e la profondità di fuoco. Posizionare un bersaglio grafico di test di risoluzione dell'US Air Force (USAF) come campione per verificare la risoluzione laterale.
5. Selezionare uno stadio di traslazione motorizzato per fornire il movimento orizzontale della piastra multipozzetto per visualizzare gli sferoidi tumorali in diversi pozzetti (vedere Figura 1B). Utilizzare un tavolino con una corsa superiore a 108 mm x 72 mm per garantire una scansione completa di tutti i pozzetti della piastra multipozzetto. Utilizza uno stadio di traslazione motorizzato bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) con controllo software per consentire la localizzazione precisa di ciascun pozzo e l'automazione del sistema OCT per l'imaging ad alta produttività.
6. Utilizza un adattatore per piastre o progetta un supporto per piastre (mediante stampa 3D) per mantenere la piastra multipozzetto in una posizione fissa.
7. Prima di eseguire qualsiasi imaging OCT, correggere l'inclinazione e la rotazione della piastra multipozzetto utilizzando uno stadio di inclinazione 2D e uno stadio di rotazione montato sullo stadio traslazionale (vedere Figura 1D) per ridurre al minimo la variazione del piano di messa a fuoco da diversi pozzetti. Utilizzare D2, D11, B6, D6 e G6 come pozzetti guida quando si monitorano le loro posizioni relative nelle immagini OCT (Figura 1A).
8. Regolare la rotazione della piastra per assicurarsi che i bordi siano paralleli alla direzione del movimento del palco in modo che i pozzetti rimangano nelle stesse posizioni orizzontali nelle immagini OCT (Figura 1E). Regolare l'inclinazione della piastra in modo che sia parallela al tavolo ottico in modo che i pozzetti rimangano nelle stesse posizioni verticali per l'imaging OCT (Figura 1F).
   NOTA: La regolazione dell'angolo di inclinazione e della messa a fuoco aiuta a ottimizzare la qualità dell'immagine OCT per tutti i pozzetti. Tuttavia, le variazioni dell'altezza dei terreni di coltura in diversi pozzetti possono causare cambiamenti nel percorso ottico che possono portare alla sfocatura dell'immagine sferoide. La messa a fuoco automatica può essere implementata per controllare il piano focale dell'imaging OCT per ottenere una qualità dell'immagine ottimizzata. La fase di regolazione non risolve la scarsa qualità dell'immagine OCT dello sferoide tumorale a causa dei seguenti problemi: decentramento dello sferoide a causa della posizione iniziale di semina; elevazione degli sferoidi quando incorporati in matrici extracellulari biofabbricate; Scarsa qualità della piastra con grandi variazioni dell'altezza dei fondi dei pozzetti. È possibile implementare un controllo software aggiuntivo con funzioni di messa a fuoco automatica o autoallineamento per ottimizzare le prestazioni del sistema di imaging OCT.
9. Per raccogliere i dati da ciascun pozzetto in sequenza, un programma informatico personalizzato controlla l'acquisizione dell'immagine OCT e il movimento del palco.

3. Scansione OCT ed elaborazione degli sferoidi tumorali

1. Il giorno dell'imaging OCT degli sferoidi tumorali, rimuovere la piastra multipozzetto dall'incubatore. Trasferirlo sotto il sistema di imaging OCT e posizionarlo sopra l'adattatore per lastre.
   NOTA: L'imaging OCT degli sferoidi tumorali può essere eseguito con il coperchio della piastra di polistirene acceso o spento. Tuttavia, le condense d'acqua sul coperchio dovute all'evaporazione dai pozzetti possono influenzare la trasmissione della luce e distorcere il percorso della luce, producendo immagini OCT meno ottimali dagli sferoidi.
2. Regolare l'altezza della piastra spostandola lungo la direzione z del tavolino di traslazione. Mantenere la posizione del piano focale a ~100–200 μm sotto la superficie superiore di ciascun sferoide, per ridurre al minimo l'effetto del profilo focale non uniforme in profondità.
3. Nel software personalizzato, impostare un intervallo di scansione OCT appropriato (ad esempio , 1 mm x 1 mm) per coprire l'intero sferoide tumorale in base alle sue fasi di sviluppo. Fare clic su Salva parametri per salvare l'impostazione.
4. Utilizza il software personalizzato per acquisire immagini OCT 3D degli sferoidi tumorali una per una per tutti i pozzetti della piastra contenente sferoidi. Fare clic sul pulsante Anteprima per visualizzare l'immagine di anteprima e fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire l'immagine dello OCT.
   NOTA: Assicurarsi che i dati degli sferoidi OCT vengano raccolti quando il tavolino non è in movimento. Lo sferoide si trova solitamente al centro del pozzo del fondo a U. Tuttavia, lo sferoide può essere spostato nei terreni di coltura quando lo stadio sta accelerando o decelerando a causa dell'inerzia dello sferoide nei terreni di coltura.
5. Elabora set di dati OCT 3D di sferoidi tumorali per generare immagini strutturali OCT con un codice di elaborazione C++ personalizzato. Vedere Figura 2A per un diagramma di flusso della post-elaborazione dei dati OCT.
   NOTA: Vedere Figura 3A per le immagini strutturali OCT 3D generate.
   1. Calibra la dimensione dei pixel in tutte e tre le dimensioni. Ridimensionare le immagini strutturali dello Strumento di personalizzazione di Office in base alle scale corrette.
      NOTA: La distanza in direzione assiale (direzione z) delle immagini OCT misura la differenza di percorso ottico tra il braccio di riferimento e il braccio campione. Pertanto, l'indice di rifrazione del campione (n) deve essere preso in considerazione quando si calibra la dimensione dei pixel in direzione assiale per il ridimensionamento. Nel nostro studio, usiamo n = 1,37 come indice di rifrazione dello sferoide tumorale.
6. Genera un collage di immagini sferoidi utilizzando immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ in sezione trasversale lungo il baricentro dello sferoide. Vedi Figura 4C–E per l'output rappresentativo di collage di immagini sferoidi. Eseguire la registrazione delle immagini per tutti gli sferoidi, utilizzando la funzione dftregistration di MATLAB, per assicurarsi che i centroidi di tutti gli sferoidi si trovino approssimativamente nella stessa posizione.
7. Ottieni un rendering 3D dello sferoide utilizzando software commerciali o personalizzati.
   NOTA: I seguenti passaggi mostrano come ottenere il rendering 3D di sferoidi tumorali utilizzando software commerciali.
   1. Caricare i dati OCT 3D nel software.
   2. Fai clic sul pannello Supera . Quindi, fai clic su Aggiungi nuovo volume. Scegli la modalità Blend da utilizzare per il rendering 3D.
   3. Regola l'angolo di visualizzazione trascinando l'immagine con il puntatore del mouse.

4. Quantificazione morfologica di sferoidi tumorali 3D

NOTA: Un codice scritto su misura in MATLAB elabora questa quantificazione. Fai clic sul pulsante Esegui per avviare il processo. Vedi Figura 2B per il diagramma di flusso delle fasi di quantificazione morfologica degli sferoidi.

1. Quantifica il diametro, l'altezza e il volume in base al diametro dello sferoide.
   1. Selezionare le immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ in sezione trasversale che attraversano il baricentro dello sferoide.
   2. Misura il diametro e l'altezza dello sferoide rispettivamente nei piani XY e XZ.
   3. Calcolare il volume sferoidale basato sul diametro utilizzando:

, con una presunzione della forma sferica del tumore.

2. Quantifica il volume degli sferoidi basati su voxel.
   1. Applicare un filtro di media 3D sui dati strutturali OCT dello sferoide per rimuovere le macchie.
   2. Segmentare gli sferoidi tumorali utilizzando il filtro Canny edge detection, fotogramma per fotogramma, con una soglia appropriata che separa la regione sferoidale tumorale dal fondo del pozzetto.
   3. Raggruppa i voxel connettivi per i dati 3D (vedi funzione integrata: bwconncomp).
   4. Calcola la distanza media tra ogni voxel connettivo del gruppo e il centroide sferoidale (scelto manualmente), per ogni gruppo. Identificare la regione sferoidale come il gruppo con la distanza media minima.
   5. Conta il numero di voxel all'interno della regione sferoidale e poi moltiplica per il volume effettivo di un singolo voxel (volume/voxel), ottenendo il volume totale dello sferoide.

5. Rilevamento della regione delle cellule morte di sferoidi tumorali 3D

NOTA: In un mezzo omogeneo, l'intensità di retrodiffusione OCT rilevata in funzione della profondità (I(z)) può essere descritta dal Legge di Beer-Lambert:

Dove {TAG_699}}z rappresenta la profondità, μ è il coefficiente di attenuazione ottica, e I0 è l'intensità dell'incidente al campione. Quindi il coefficiente di attenuazione ottica derivato può essere espresso come:

Poiché le immagini OCT sono spesso tracciate su una scala logaritmica, la pendenza del profilo di intensità OCT può essere recuperata per derivare il coefficiente di attenuazione ottica. Vedi Figura 2C per un diagramma di flusso della generazione delle mappe di attenuazione ottica.

1. Eseguire la segmentazione per rimuovere le regioni indesiderate al di fuori dello sferoide. Eseguire un filtro medio 3D per eliminare il rumore di macchie intrinseco nelle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office.
2. Ottenere coefficienti di attenuazione ottica pixel per pixel adattando in modo lineare il profilo di intensità OCT su scala logaritmica su un determinato intervallo di profondità (finestra mobile), estraendone la pendenza e moltiplicando la pendenza per -1/2.
   NOTA: Il coefficiente di attenuazione ad ogni voxel all'interno della regione sferoidale segmentata è calcolato in base alla pendenza del profilo di intensità OCT in una finestra di profondità di 10 voxel (~40 μm di profondità), con il voxel situato al centro della finestra.
3. Applicare i metodi di cui sopra (passaggi 5.1 e 5.2) a ciascuna scansione assiale in un fotogramma e a ciascun fotogramma in un set di dati 3D contenente la regione sferoidale segmentata fino a quando non vengono calcolati i coefficienti di attenuazione ottica per tutti i voxel della regione sferoidale segmentata.
4. Eseguire la soglia binaria per evidenziare la regione ad alta attenuazione.
   Evidenziate la mappa di attenuazione ottica binarizzata sull'immagine originale per etichettare la regione delle celle morte (fusione). Genera l'immagine renderizzata in 3D della mappa di attenuazione miscelata per visualizzare la distribuzione 3D della regione delle celle morte.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di imaging OCT su ordinazione nel dominio spettrale			Sviluppato nel nostro laboratorio
Diodo superluminescente (SLD)	Thorlabs	SLD1325	Sorgente luminosa
2×22 accoppiatore in fibra fusa monomodale, 50:50 Rapporto di divisione 50	AC Photonics	WP13500202B201
{Braccio di riferimento		{{}}
Lens Tube	Thorlabs
Thorlabs
Lente di collimazione	Thorlabs	AC080-080-0} 20-C
Lente di messa a fuoco	Thorlabs
Thorlabs
Mirror	Thorlabs	{{}}
1D Stadio Traslazionale	Thorlabs
Thorlabs
{Posta pedonale	Thorlabs
Forcella di serraggio	Thorlabs
Braccio campione
Tubo dellente	Thorlabs
Adattatore	Thorlabs
Lente di collimazione	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanometro	Thorlabs{{}}Thorlabs{{}} {}}{{}}{{}}{{}}Galvanometro{{}}{{}}Thorlabs{{}}Thorlabs
Lente a relè	Thorlabs	AC254-100-C	Due lenti a relè per fare un telescopio configurazione
Montaggio a specchio triangolare	Thorlabs
Specchio	Thorlabs
Objective	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
TAG_243}}	Thorlabs
{Forcella di serraggio
Controllore di polarizzazione	Thorlabs		{{ TAG_269}}
Montaggio a gabbia da 30 mm	Thorlabs
Asta a gabbia	Thorlabs
Stage			{{ TAG_299}}
{}} TAG_303}}	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	JTH360XY
2D Palcoscenico inclinabile
{Stadio di rotazione	{{TAG_ 325}}
Portatarga			05 TAG_339 TAG_340}{} }
Spettrometro
Tubo dellente	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Adattatore	Thorlabs
Lente di collimazione	Thorlabs	AC080-020-C
TAG_383}}	Wasatch{{TAG_ 386}}	G = 1145 lpmm
F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
Telecamera a scansione lineare InGaAs	Sensore illimitato	SU1024-LDH2
Componente di coltura cellulare{{TAG_ 414}}
HCT 116 Linea cellulare	ATCC	CCL-247
Pallone per colture cellulari	SPL Scienze della vita	70025
Pipetta	Fisherbrand	14388100
Puntali per pipette	Sorenson Bioscience	10340{{}}10340{{}}{TAG_459}}
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Siero fetale bovino, certificato, origine USA	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiotico-Antimicotico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning 96-well clear round bottom ultra-low attachment micropiastra	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.07.001 4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 CO2 incubatore	Thermo Fisher Scientific	3120
Guanti	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
Pipette di trasferimento	Globe Scientific	138080
Centrifuga	Eppendorf	5702 R	Per centrifugare la provetta da 15 mL
Centrifuga{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Per centrifugare la piastra a 96 pozzetti
Microscopio	Olympus
Elenco degli OCT commerciali
Sistema SD-OCT	Thorlabs	Telesto Series
{}{Sistema SD-OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Software per l'analisi dei dati{{TAG_ 637}}
Analisi di base delle immagini	NIH	ImageJ	Fiji funziona.
Rendering 3D	Thermo Fisher Scientific	Amira	Software commerciale. Opzione 1
Rendering 3D	Bitplane	Imaris	Software commerciale. Opzione 2. Utilizzato nel protocollo
Software di acquisizione OCT			personalizzato sviluppato in C++.
Controllo di scena	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporato nel codice di acquisizione OCT personalizzato
Software di elaborazione OCT			sviluppato su misura in C++. Utilizza la GPU. Incorporato nel codice di acquisizione dello Strumento di personalizzazione di Office personalizzato.
Analisi morfologica e fisiologica			sviluppato su misura in MATLAB

{{ TAG_62}}Adattatore{{TAG_ 92}}Montatura a specchio cinematico{{ TAG_122}}Filtro a densità neutra continua{{}}{{}}{{}}{TAG_136}} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}}{{}}{{}}Galvanometro{{}}{}}Thorlabs{{}}Thorlabs{{}}{}} {TAG_196}} {{}}{{TAG_254 {{{}}{{ {}}{TAG_400{ }}{{TAG_ 473}}{{}}{}} {{}} }} }{{ TAG_610}}