Imaging di polisomi isolati da un cervello di topo mediante microscopia a forza atomica

Abstract

Fonte: Lunelli, L., et. al. Scrutare i polisomi cerebrali con la microscopia a forza atomica. J. Vis. Exp.(2016).

Questo video mostra l'imaging dei polisomi utilizzando la microscopia a forza atomica. Un foglio di mica rivestito di ioni nichel ancora l'RNA con i ribosomi attaccati. Il campione viene lavato, asciugato e montato sul tavolino del microscopio. La punta a sbalzo scansiona la superficie del campione, registrando le deflessioni laser per mappare la topologia. Il software viene utilizzato per correggere le distorsioni e visualizzare strutture polisomiali ad alta risoluzione.

Protocol

Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell'RNA dei campioni, preparare tutti i tamponi utilizzando acqua trattata con DEPC per ridurre al minimo la contaminazione da RNasi.

1. Preparazione di polisomi da cervelli interi

1. Raccolta di tessuti cerebrali (15 min)
   1. Eutanasia del ceppo di topo selvatico C57BL/6 con asfissia CO₂ per 5 min. Sezionare con cura il cervello dal cranio, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e immergerlo immediatamente nell'azoto liquido. Conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparazione del lisato (30 min)
   1. Polverizzare l'intero tessuto cerebrale usando un mortaio e un pestello sotto azoto liquido.
   2. Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta da microcentrifuga fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedere la Tabella 1) e disgregare la cellula pipettando su e giù 25 volte rapidamente.
   3. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 1 min a 4 °C per pellettare i detriti cellulari.
   4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga e tenere la provetta in ghiaccio per 15 minuti.
   5. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare i nuclei e i mitocondri.
   6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
   7. Conservare il surnatante a –80 °C per un massimo di 6 mesi o utilizzarlo immediatamente.
3. Preparazione e centrifugazione del gradiente di saccarosio (2 ore e 30 minuti)
   1. Lavare ampiamente le provette per ultracentrifuga con acqua priva di RNasi (acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) e 3% di H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O soluzione.
   2. Mettere le provette sul ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione fredda di saccarosio al 50% sul fondo di ogni provetta (vedere Tabella 1 per le soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la soluzione di saccarosio al 15% goccia a goccia, rimanendo vicino all'interfase in modo da mantenere un'interfase nitida fino al completo riempimento del tubo. Quando il tubo è completamente pieno, chiuderlo con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d'aria.
   3. In una cella frigorifera, stendere delicatamente i tubi orizzontalmente e tenerli in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, raddrizzare lentamente i tubi in posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio al 15-50% utilizzando un formatore di gradiente convenzionale.
   4. In una cella frigorifera, rimuovere con cautela 1,0 ml dalla parte superiore del gradiente e sovrapporre il saccarosio goccia a goccia con il lisato citosolico (cioè il surnatante ottenuto al punto 1.2).
   5. Abbassare con cautela i tubi nelle benne del rotore della benna oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 minuti a 180.000 x g a 4 °C utilizzando un'ultracentrifuga.
   6. Dopo la centrifugazione, lasciare le provette nei loro secchi per 20 minuti a 4 °C per stabilizzare i gradienti.
4. Frazionamento in gradiente di saccarosio (2 ore)
   1. Rimuovere con cautela una provetta per ultracentrifuga dal rotore dell'ultracentrifuga e montarla sul dispositivo collettore di un sistema di frazionamento a gradiente di densità. Raccogliere frazioni da 1 ml per monitorare l'assorbanza a 260 nm con un rivelatore UV/VIS (vedere Figura 1 pannello superiore). Conservare le frazioni raccolte sul ghiaccio.
   2. Preparare aliquote di 30-40 μl delle frazioni di interesse. Conservarli in ghiaccio prima di riporli a -80 °C fino al momento dell'uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di congelamento-scongelamento (vedi Figura 1 pannello inferiore).

2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore)

1. Utilizzando del nastro adesivo, staccare i fogli di mica.
2. Lavare i fogli di mica 3-4 volte con acqua DEPC e metterli in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con aria.
3. Coprire la mica con 200 μl di 1 mM di NiSO₄ e incubare per 3 minuti a RT.
4. Rimuovere la soluzione di nichel e quindi asciugare la superficie con aria. Eseguire tutti i passaggi successivi a 4 °C posizionando la capsula di Petri con la mica sul ghiaccio.
5. Scongelare un'aliquota ottenuta al punto 1.4.2 su ghiaccio e aggiungere delicatamente tutto il campione goccia a goccia alla mica. Utilizzando una punta da 100-200 μl, stendere il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione su ghiaccio per 3 min.
6. Coprire il foglio di mica goccia a goccia con 200 μl di Buffer-AFM (vedi ) e incubare per 1 ora su ghiaccio.
7. Imaging in liquido
   1. Rimuovere con cura il microscopio a forza atomica tampone (AFM) e lavare i fogli di mica 3-4 volte con 200 μl di tampone-AFM freddo per rimuovere il saccarosio in eccesso. Quindi, lavare i fogli di mica 3 volte con una soluzione di lavaggio fredda (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica coperta da alcuni microlitri di soluzione.
   2. Andare al punto 3 (Acquisizione dell'immagine).
8. Imaging in aria
   1. Rimuovere con cura il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 μl di Buffer-AFM freddo per rimuovere il saccarosio in eccesso. Quindi, lavare la mica 3 volte con una soluzione di lavaggio fredda (vedi Tabella 1) e scolare l'acqua in eccesso usando la carta.
   2. Lasciare asciugare il campione sotto la cappa chimica con la parte superiore della capsula di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la capsula di Petri e conservarla a temperatura ambiente (RT). Misurare il campione dopo 2-3 ore, poiché sono stabili per anni.

3. Acquisizione dell'immagine (15 minuti per immagine dopo la stabilizzazione termica)

Nota: I polisomi immobilizzati sulla mica possono essere ripresi in aria o in liquido utilizzando la modalità AC.

1. Fissare la mica al portacampioni utilizzando del nastro biadesivo.
2. Inserire il sample holder nel palco AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando si esegue l'imaging in un liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione a una temperatura inferiore a 25 °C per aumentare la stabilità dei polisomi nel tempo.
3. Selezionare un cantilever adatto per l'imaging AC e montarlo sul supporto della punta seguendo le indicazioni del produttore. In questo caso, utilizzare cantilever con una costante di forza compresa tra 2 e 20 N/m per l'imaging dell'aria e circa 0,1 N/m per l'imaging dei liquidi.
4. Regolare il punto laser sul cantilever e azzerare i segnali del rivelatore del quadrante.
5. Selezionare una frequenza di guida appropriata e azionare il cantilever con un'ampiezza di 10-20 nm.
6. Avvicinarsi al campione fino a quando la punta non si innesta sulla superficie.
7. Seleziona un'area di scansione di 2x2 μm, acquisisci immagini di almeno 512x512 pixel (larghezza pixel < 4 nm) e seleziona una modalità di sottrazione dello sfondo in tempo reale e una scala Z di 20-25 nm.
8. Ispezionare l'immagine cercando la presenza di oggetti rotondi caratterizzati da un'altezza compresa tra 10 e 15 nm quando acquisiti in aria e 25 e 30 nm quando in liquido e la larghezza nell'intervallo 25-30 nm. Regolare il setpoint e i parametri di feedback fino a visualizzare gli oggetti appuntiti. Lo sfondo dovrebbe apparire relativamente piatto in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza di 2-4 nm (vedi Figura 2A e B).
9. Se l'immagine appare buona (come indicato al punto 3.8), acquisire diverse (almeno dieci) scansioni 2x2 micron in diverse aree del campione.
10. (facoltativo). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione dei polisomi selezionati (vedi Figura 2C).
11. Applica correzioni software (algoritmi di sottrazione piana e correzione riga per riga) per correggere le immagini AFM, rimuovendo gli effetti arbitrari di inclinazione e deriva.

4. Analisi dei dati (30 minuti per immagine)

1. Esportare le immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) utilizzando preferibilmente un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio il formato TIFF (vedere Figura 3A).
2. Utilizzare il set di strumenti macro ImageJ RiboPick.ijm (da copiare nella sottodirectory macro/set di strumenti ImageJ) per contare i ribosomi nei polisomi (vedere Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedere Figura 3C).
   1. Inizia a caricare un'immagine utilizzando lo strumento che inizializza il programma.
   2. Selezionare i centri dei ribosomi con lo strumento standard ImageJ (Maiusc + clic sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Contrassegnare i ribosomi selezionati con lo strumento . Le coordinate dei ribosomi appariranno in una finestra di testo personalizzata.
   3. Aggiungere più ribosomi allo stesso polisoma, ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2.
   4. Rimuovi i ribosomi contrassegnati in modo errato utilizzando lo strumento (inizia a rimuovere dall'ultimo ribosoma aggiunto al primo, solo nel polisoma corrente).
   5. Quando il polisoma è completato, utilizzare lo strumento . Quando il numero di polisoma viene aggiunto come sovrapposizione all'immagine, la finestra di testo viene aggiornata.
   6. Utilizzare l' per scrivere il file delle coordinate del ribosoma (vengono utilizzate le unità predefinite dell'immagine) e un'immagine PNG che riepiloga i ribosomi e i polisomi selezionati. L'immagine originale viene chiusa senza essere salvata.

Tabella 1. Buffer.

10 mM Tris–HCl, pH 7.000 5

10 mM NaCl

Buffer		{{}}{}}{Application
{{}}TAG_544	Preparazione del lisato (1.1)
	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2
	1% Triton-X100
	1% Na-desossicolato
	0.0.4 U/ml Inibitore della RNasi
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0.0.2 mg/ml di cicloesimide
	{{ TAG_673}}5 u/ml dnase i
soluzione di saccarosio al 50%{{TAG_687 Saccarosio in {TAG_688 TAG_694}}	50% (p/v) di saccarosio in {{}}	preparazione del gradiente (1.1.) 2)
	100 mM NaCl
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7..5
Soluzione di saccarosio al 15%	{{{ TAG_764}}15% (p/v) di saccarosio in	Preparazione del gradiente di saccarosio (1.1.2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7..}}{5
Soluzione di nichel	1 mM NiSO4	Preparazione del campione per AFM (2)
Buffer-AFM	100 mM NaCl	{{}}}{}{Preparazione del campione per AFM (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml cicloesimide{{}} TAG_908}}
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	3% (p/v) saccarosio pH = 7..}} pH = 7..}} 4
Soluzione	DEPC-Water	Preparazione del campione per AFM (2)
	100 μg/ml cicloesimide {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{TAG_568 TAG_569}}{{}}{}}{}{{{ TAG_610}}{}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials