Imaging micro-CT con mezzo di contrasto di lesioni da malformazione cavernosa cerebrale in un cervello di topo

Abstract

Fonte: Choi, J. P. et al. Induzione e imaging micro-CT di malformazioni cavernose cerebrali in modello murino. J. Vis. Exp. ( 2017)

Questo video dimostra l'uso dell'imaging micro-CT per visualizzare le lesioni della malformazione cavernosa cerebrale (CCM) nel cervello di un topo. Descrive in dettaglio le fasi per la preparazione del campione, l'imaging e la ricostruzione dell'immagine 3D per valutare la densità e la posizione delle lesioni CCM nel tessuto cerebrale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del campione per scansioni di tomografia microcomputerizzata (TC)

1. Eutanasia dei cuccioli neonatali a P8 tramite asfissia da anidride carbonica.
2. Eseguire la perfusione intracardiaca inserendo un ago calibro 29 con 3 mL di paraformaldeide al 2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in una siringa da 10 mL nel ventricolo del cuore del topo.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica; Indossare una protezione adeguata.
3. Staccare la testa dal corpo usando le forbici. Rimuovi tutta la pelle dalla testa usando una forbice e stacca il cranio usando una pinza per sezionare l'intero cervello.
4. Scatta immagini del cervello con uno stereomicroscopio con ingrandimento 7,82x, guadagno 1x, gamma 0,6 e tempo di esposizione di 20 ms.
5. Fissare i cervelli sezionati con il 4% di paraformaldeide in soluzione PBS durante la notte.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica; Indossare una protezione adeguata.
6. Il giorno seguente, staccare il rombencefalo usando una pinza e lavare con una soluzione di PBS.
7. Incubare i rombencefali nella soluzione di iodio di Lugol per 48 ore.
8. Dopo l'incubazione, asciugare brevemente all'aria i rombencefali per rimuovere la soluzione di iodio di Lugol in eccesso.
9. Imballare i rombencefali colorati con iodio di Lugol in provette da microcentrifuga da 0,65 ml e sigillarli completamente con un film di paraffina di plastica per evitare il restringimento dei tessuti (Figura 1A).
10. Posizionare le provette per microcentrifuga in provette di plastica da 5 mL con spugne per evitare che si muovano durante la scansione (Figura 1B).

2. Scansione Micro-CT di malformazioni cavernose cerebrali (CCM) nel cervello del topo

1. Montare verticalmente il rombencefalo imballato in un tubo su un supporto di alluminio nel sistema micro-CT.
2. Impostare i parametri di scansione su 540 proiezioni e 2 s di tempo di esposizione con condizioni della sorgente di 50 kV e 10 W per acquisire i set di dati tomografici (risoluzione dell'immagine 9,5 μm/pixel).
3. Le radiografie della scansione vengono ricostruite automaticamente dal software di ricostruzione della proiezione basato su hardware fornito dal sistema micro-CT, producendo una serie di immagini di fette assiali a 16 bit (file "TXM").

3. Analisi di set di dati Micro-CT

1. Apri il file immagine ricostruito (file "TXM") nel software di analisi 3D e visualizza il cervello utilizzando la funzione "rendering del volume".
2. Trasforma il rombencefalo nell'orientamento desiderato utilizzando le funzioni "riquadro di delimitazione" e "piano di ritaglio".
3. Ricampiona l'immagine trasformata in modalità estesa e mantieni le dimensioni dei voxel.
4. Crea "modifica nuovo campo etichetta" sull'immagine trasformata (3.3) ed evidenzia solo il rombencefalo utilizzando l'intensità della scala di grigi.
5. Aggiungi le aree evidenziate ed esegui "analisi delle etichette" per ottenere misurazioni dell'intero romboencefalo (i.e., volume totale e area). Esporta le misure in un file Excel.
6. Visualizza il rombencefalo utilizzando la funzione "isosurface rendering".
7. Crea un altro "modifica nuovo campo etichetta" sull'immagine trasformata ed evidenzia le aree con lesioni utilizzando l'intensità della scala di grigi.
8. Aggiungi le aree evidenziate ed esegui l'analisi "etichetta" per ottenere misurazioni delle lesioni all'interno del rombencefalo (cioè , volume totale e area). Esporta le misure in un file Excel.
9. Visualizzare le lesioni utilizzando le funzioni "genera superficie" e "vista superficie".
10. Istantanea le immagini del rombencefalo con gli orientamenti desiderati o genera un filmato per la visualizzazione 3D delle lesioni.

Risultati

Materiali