Imaging a doppia fluorescenza per identificare gli oligodendrociti differenziati

Abstract

Fonte: Schott, J. T., {et al. Preparazione di colture progenitrici di oligodendrociti di ratto e quantificazione dell'oligodendrogenesi mediante scansione a fluorescenza a doppio infrarosso. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra l'uso dell'imaging a doppia fluorescenza per valutare la differenziazione degli oligodendrociti da cellule precursori (OPC) isolate dal cervello di un cucciolo di ratto. Il processo include il fissaggio delle cellule, l'etichettatura di marcatori specifici con anticorpi primari e secondari coniugati con fluorofori e la loro visualizzazione utilizzando l'imaging a fluorescenza. Vengono identificati oligodendrociti differenziati che esprimono sia la proteina basica della mielina (MBP) che il fattore di trascrizione degli oligodendrociti 2 (Olig2), distinguendoli dalle cellule precursori indifferenziate che esprimono solo Olig2.

Protocollo

1. Preparazione di piastre di saggio, soluzioni madre e terreni di base OPC

Nota: Il terreno di base OPC di ratto (Sato) qui descritto è stato derivato da studi precedentemente pubblicati. Anche formulazioni di terreni alternativi possono essere compatibili con questa procedura.

1. Risospendere la poli-L-lisina (PLL) a una concentrazione di 10 μg/ml in acqua deionizzata sterile. Pipettare 400 μl di PLL diluito in ciascun pozzetto di una piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti, con parete nera e fondo trasparente.
2. Rivestire le piastre di coltura tissutale per 2 ore in un incubatore per colture tissutali a 37 °C o per una notte in un frigorifero a 4 °C.
3. Aspirare PLL dalle stoviglie rivestite almeno 20 minuti prima della placcatura. Lasciare asciugare il PLL rimanente dal pozzetto posizionando piastre da 24 pozzetti con il coperchio parzialmente socchiuso in una cappa di coltura tissutale. Verificare che i pozzetti siano completamente asciutti prima di galvanizzare gli OPC isolati. Le celle non aderiranno alla plastica che contiene PLL liquido.
4. Preparare N-Acetil-L-cisteina (NAC) soluzione madre (1.000x): Sciogliere 100 mg di N-Aetil-L-cisteina (NAC) in 20 ml di terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM). Aliquotare e conservare a -20 °C.
5. Preparare la soluzione madre di idrocortisone (1.000x): aggiungere 1 ml di etanolo a 1 mg di idrocortisone e agitare per sciogliere. Aggiungere 19 ml di DMEM, mescolare la soluzione, aliquotare e conservare a -20 °C. È stato dimostrato che l'aggiunta di idrocortisone al terreno di base migliora la sopravvivenza delle cellule gliali.
6. Preparare la soluzione madre di d-biotina (5.000x): sciogliere 2,5 mg di d-biotina in 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 1-2 gocce da 5 μl di NaOH 0,1 N per favorire la dissoluzione. Aliquotare e conservare a -20 °C.
7. Preparare la soluzione madre di insulina (100x): Sciogliere 25 mg di insulina in 50 ml di acqua per colture tissutali. Aggiungere 250 μl di HCl 1 N e mescolare fino a quando la soluzione è limpida. Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 6 settimane.
8. Preparare la soluzione madre di Sato (100x):
   1. Preparare la soluzione madre di progesterone (25 μg/μl): Sciogliere 2,5 mg di progesterone in 100 μl di etanolo.
   2. Preparare la soluzione madre di selenito di sodio (400 ng/μl): Sciogliere 4 mg di selenito di sodio in 100 μl di NaOH 0,1 N. Aggiungere 10 ml di DMEM e mescolare.
   3. A 100 ml di DMEM, aggiungere 1 g di apo-transferrina umana, 1 g di albumina sierica bovina e 160 mg di putrescina e mescolare per sciogliere completamente. Aggiungere 25 μl di soluzione madre di progesterone, 1.000 μl di soluzione madre di selenito di sodio e mescolare. Aliquotare e conservare a -20 °C.
9. Preparare i terreni di base OPC: per 100 ml di DMEM (con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina e 110 mg/L di piruvato di sodio), aggiungere 100 μl di NAC, 100 μl di idrocortisone, 20 μl di d-biotina, 1 ml di insulina, 1 ml di brodo Sato, 100 μl di oligoelementi B, 2 ml di integratore di B-27 (50x) e 1 ml di penicillina/streptomicina (100x). Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
10. Preparare la soluzione madre del fattore di crescita derivato dalle piastrine AA (PDGF-AA) (1.000x): Sciogliere 250 μg in 12,5 ml di PBS con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% per ottenere una soluzione da 20 μg/ml. Aliquotare e conservare a -80 °C.
11. Preparare i terreni di proliferazione OPC: terreni di base OPC integrati con 20 ng/ml di PDGF-AA.
12. Preparare i terreni di differenziazione OPC: terreni di base OPC integrati con triiodotironina 45 nM.
13. Preparare il tampone della colonna: a 500 ml di PBS, aggiungere 2,5 g di BSA e 2 ml di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA) e regolare il pH a 7,2. Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.

2. Induzione della differenziazione e fissazione OPC con paraformaldeide al 4%

Nota: Quando testiamo l'effetto di piccole molecole sull'oligodendrogenesi, dissolviamo abitualmente farmaci in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare 1.000 stock che possono poi essere conservati a -80 °C e diluiti direttamente in terreni SATO per ottenere una concentrazione finale dello 0,1% DMSO. Non abbiamo osservato cambiamenti né nella proliferazione né nella differenziazione di OPC utilizzando questa concentrazione di DMSO (dati non mostrati).

1. Preriscaldare i terreni di base OPC a 37 °C e scongelare le scorte per il trattamento dei farmaci a temperatura ambiente. Quando si eseguono trattamenti in duplicato, preparare circa 1,25 ml di terreno per gruppo di trattamento in una provetta da 1,5 ml. Per i campioni triplicati, utilizzare provette da centrifuga da 2 ml per tenere conto dell'allentamento.
2. Preparare le miscele master di trattamento per pozzetti di replicazione diluendo le stock di trattamento direttamente in terreni di base OPC. Agitare brevemente o mescolare delicatamente ogni mastermix per garantire una distribuzione omogenea del trattamento.
3. Preparare 45 nM di triiodotironina (T₃) come controllo positivo e il veicolo appropriato come controllo negativo. Diluire 10 mM di T₃ stock 1:1.000 in 1 ml di terreno base OPC e quindi diluire ulteriormente nella miscela master di trattamento per ridurre la concentrazione finale di DMSO, se necessario.
4. Aspirare i terreni dai pozzetti di coltura un gruppo di trattamento alla volta in modo da evitare l'essiccazione delle cellule. Utilizzare un puntale da 200 μl all'estremità della pipetta Pasteur in vetro per evitare di raschiare via il materiale nero dai lati del pozzetto e nella coltura.
5. Aggiungere lentamente 500 μl di mastermix di trattamento lungo il lato del pozzetto utilizzando una pipetta da 1 ml.
6. Incubare le colture per il periodo di tempo desiderato, eseguendo uno scambio completo di terreni con terreni di trattamento freschi ogni 2-3 giorni. Osserviamo abitualmente una coltura MBP⁺ MBP del 30-40% dopo 4 giorni nei terreni di differenziazione.
7. Al termine del periodo di trattamento desiderato, preparare una paraformaldeide fresca al 4% (PFA) o scongelare un brodo congelato a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il PFA è estremamente tossico e deve essere preparato in una cappa aspirante.
8. Aspirare il terreno e aggiungere lentamente 400 μl di PFA sul lato del pozzetto per fissare le cellule. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente.
9. Aspirare il PFA e aggiungere lentamente 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco sterile (D-PBS, con Ca²⁺ e Mg²⁺) sul lato del pozzetto per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio per un totale di altre due volte. Non aspirare il lavaggio finale.
10. Avvolgere la lastra in parafilm e conservarla a 4 °C per la successiva lavorazione o procedere direttamente alla fase successiva. Le piastre possono essere conservate per diverse settimane.

3. Immunocitochimica e quantificazione della proteina basica della mielina

Nota: Quando si eseguono procedure di manipolazione dei liquidi sulle piastre a 24 pozzetti, si raccomanda di lavorare velocemente per evitare di asciugare le cellule. In questo caso, si consiglia l'uso di un aspiratore a vuoto multicanale e di una pipetta multicanale.

1. Portare la piastra a temperatura ambiente, aspirare i pozzetti e aggiungere 250 μl di D-PBS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) contenente lo 0,1% di Triton X-100 e il 5% di siero normale di capra (NGS). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente gli orbitali.
2. Preparare la soluzione di incubazione primaria diluendo l'anticorpo monoclonale anti-MBP di topo 1:1.000 e l'anticorpo policlonale anti-actina di coniglio 1:200 in D-PBS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) contenente il 5% di NGS. In alternativa, l'anti-Olig2 policlonale di coniglio a 1:1.000 può essere utilizzato per la normalizzazione specifica degli oligodendrociti in colture gliali miste. Preparare una quantità sufficiente di soluzione primaria per contenere 250 μl per pozzetto.
3. Incubare gli anticorpi primari a 4 °C per una notte per 16-18 ore con un leggero agitamento orbitale.
4. Aspirare la soluzione di incubazione primaria e lavare le cellule 3 x 10 min con 500 μl di D-PBS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) a temperatura ambiente con leggero agitamento orbitale.
5. Durante il lavaggio della piastra, preparare la soluzione di incubazione secondaria diluendo gli anticorpi anti-topo 680 e anti-coniglio 800 1:500 in D-PBS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) contenente il 5% di NGS. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambientale durante la preparazione di questa soluzione.
6. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 250 μl di soluzione di incubazione secondaria. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente gli orbitali.
7. Aspirare la soluzione di incubazione secondaria e lavare i pozzetti 3 x 10 min con 500 μl di D-PBS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) a temperatura ambiente con leggero agitamento orbitale.
8. Scansiona la lastra utilizzando un sistema di imaging in grado di rilevare emissioni di fluorescenza a 700 nm e 800 nm. Come punto di partenza, impostare l'offset focale su 3 e le sensibilità su 1,5 per MBP, 5,0 per Actin e 3,5 per Olig2. Regolare i valori di sensibilità secondo necessità per evitare la sovraesposizione del segnale.
9. Quantificare l'entità dell'oligodendrogenesi utilizzando metodi semi-automatizzati basati su software.
   1. Utilizzando il software, impostare la modalità di analisi della piastra su "24 pozzetti" e allineare i cerchi attorno al perimetro esterno dei pozzetti scansionati. Impostare il canale di normalizzazione su "800" ed esportare le intensità di fluorescenza totali e relative per i canali 700 nm (MBP) e 800 nm (Olig2/Actina).
   2. Dividere l'intensità a 700 nm per l'intensità a 800 nm per ottenere l'espressione normalizzata dell'MBP in unità di fluorescenza relative. Calcolare la media delle misurazioni replicate e scalare l'espressione ai controlli Giorno 0 + PDGF in base alle esigenze dell'analisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Materiali CulturaliPDGF-AAPeproTech Inc100-13A20 ng/mLDimethyl sulfoxide<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-AldrichD2650Hybri-Max 100 mLTriiodotironina Sigma-AldrichT639745 nMClemastine fumarato saltSigma-AldrichSML0445-100MG1 μMSale di emifumarato di quetiapinaSigma-AldrichQ3638-10MG1 μMN-acetyl cysteineSigma-AldrichA91655 μg/mLProgesteroneSigma-AldrichP878360 ng/mLPoly-L-lysine<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-AldrichP152410 μg/mLPutrecineSigma-AldrichP750516 μg/mL<tr style='height:20px;'>Selenito di sodioSigma-AldrichS526140 ng/mLHydrocortisoneSigma-AldrichH013550 ng/mLd-BiotinSigma-AldrichB463910 ng/mLInsulin<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-AldrichI66345 μg/mLApo-TransferrinSigma-AldrichT1147100 μg/mLAlbumina sierica bovinaSigma-AldrichA4161100 μg/mLTrace Elements BCorning25-022-Cl1 x B-27 Supplement<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Life Technologies175040441 x Penicillina/StreptomycinLife Technologies151401221 x DMEMLife Technologies11995-0651 x 24-well Black Visiplate con coperchioPerkin Elmer1450-605<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Tissue culture grade Immunocitochimica e QuantificazionePFASigma-Aldrich100-13A4%Triton X-100Sigma-Aldrich787870.10%Normal Goat SerumJackson Immuno Research005-000-1215%mouse monoclonal anti-MBPBiolegendSMI-99P1:1000 Diluizionerabbit polyclonal anti-Actin<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Santa Cruz BiotecnologySC-72101:200 Diluitionconiglio policlonale anti-Olig2MilliporeAB96101:1000 Diluitioncapra anti-mouse 680RDLicor926-680701:500 Diluitioncapra anti-coniglio 800CWLicor926-322111:500 DiluitionAlexa Fluor 594 capra anti-mouseLife TechnologiesA11032<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>1:000 diluitionAlexa Fluor 488 capra anti-coniglioLife TechnologiesA11008diluizione 1:000Prolong Gold antifade con DAPILife TechnologiesP36931 DPBS con Ca2+ e Mg2+Corning21-030-CV Licor Odyssey Clx Infared Imaging SystemLicor