Visualizzazione dei mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche

Abstract

Fonte: Hamid, H. S., et al. Imaging tridimensionale e analisi dei mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche umane. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra il metodo per visualizzare i mitocondri nervo-specifici utilizzando l'imaging tridimensionale. Delinea il processo di acquisizione di scansioni sequenziali di fibre nervose intraepidermiche pre-marcate e la generazione di immagini di superficie 3D per isolare e visualizzare i mitocondri in relazione alle strutture nervose.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Imaging confocale

1. Eseguire l'imaging confocale:
   1. Raccogli immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo a immersione in olio 40X (apertura numerica 1,25 (N.A.)) su un microscopio invertito.
      1. Su ciascun piano focale, acquisire in sequenza segnali fluorescenti:
         Nuclei: eccitazione λ = 405 nm, filtro di emissione spettrale λ = 420 - 480 nm
         Fibre nervose: eccitazione λ= 488 nm, filtro di emissione spettrale λ = 505 - 560 nm
         Mitocondri: eccitazione λ = 543 nm, filtro di emissione spettrale λ= 606 - 670 nm
   2. Inserire i seguenti parametri di scansione nel software del microscopio: velocità di scansione di 600 Hz con media di 2 fotogrammi e zoom di 2,2; Risoluzione dell'intensità a 12 bit (4096 livelli di grigio).
      1. Impostare il software del microscopio per ottimizzare la risoluzione laterale (risoluzione di scansione = 1.024 x 1.024) e la risoluzione assiale/sezionamento ottico (apertura confocale = 1 unità di arieggiamento (AU) con dimensione del passo z di 210 nm).
         NOTA: La risoluzione XYZ risultante è 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm con una dimensione dell'immagine di 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
   3. Attiva una scansione in tempo reale per il segnale nervoso (fluorescenza verde) e regola il Controllo Z-Focus per trovare e impostare i piani focali superiore e inferiore nel software del microscopio che racchiudono il segnale nervoso all'interno della sezione di tessuto. L'intervallo z totale è tipicamente di 30-50 μm per una sezione di tessuto di 50 μm.
   4. Ruotare il campo di scansione con il software del microscopio durante una scansione dal vivo in modo che l'epidermide sia posizionata orizzontalmente o verticalmente nell'immagine.
   5. Scansiona ogni segnale separatamente e regola la tensione e l'offset del rivelatore (tubo fotomoltiplicatore, PMT) per ridurre al minimo/rimuovere eventuali pixel sovra e sottosaturi.
      NOTA: I tempi di scansione con i parametri di cui sopra richiedono circa 20 - 40 minuti, a seconda del numero di z-slice.

2. 3D Visualizzazione e analisi dei mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche umane

1. Isolare l'epidermide 3D:
   1. Duplicare l'immagine originale e utilizzare la proiezione di massima intensità (visione a fuoco esteso) dell'immagine per identificare e isolare l'epidermide.
   2. Utilizzare uno strumento per la regione di interesse per tracciare lungo i bordi superiore e inferiore dell'epidermide per rimuovere le aree indesiderate, come lo strato corneo e il derma, che sono prive di fibre nervose intraepidermiche. Ritaglia in base a questa selezione.
2. Utilizzare la deconvoluzione sul nervo e i segnali fluorescenti mitocondriali:
   NOTA: La deconvoluzione aiuta a ripristinare l'integrità dei segnali fluorescenti. Il restauro utilizzato in questo protocollo è chiamato deconvoluzione cieca perché utilizza i segnali fluorescenti nelle immagini per determinare quanto i segnali si diffondono dalla loro sorgente originale (funzione di diffusione del punto). Il processo migliora la risoluzione del segnale riassegnando la diffusione del segnale alla sua posizione di origine.
   1. Calcola una funzione di diffusione dei punti (PSF) per il segnale nervoso fluorescente verde (fluorescenza verde) con i seguenti parametri:
      1. Imposta la PSF calcolata su confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio su 1,515 e l'apertura numerica su 1,25. Impostare il foro stenopeico del rilevatore su 1 UA. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser su 488 nm e la lunghezza d'onda di emissione su 515 nm.
   2. Calcola una PSF per il segnale mitocondriale fluorescente rosso (fluorescenza rossa) con i seguenti parametri:
      1. Imposta la PSF calcolata su confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio su 1,515 e l'apertura numerica su 1,25. Impostare il foro stenopeico del rilevatore su 1 UA. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser a 543 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 617 nm.
   3. Ottimizza i segnali fluorescenti dei nervi e dei mitocondri mediante deconvoluzione utilizzando le corrispondenti PSF sopra elencate e la funzione di ripristino iterativo impostata al 100% di confidenza e un limite di iterazione di 10 cicli.
3. Crea superfici nervose specifiche:
   1. Usa lo strumento "crea superficie" per creare una superficie solida dei nervi dalla marcatura secondaria fluorescente verde deconvoluta dei nervi identificati dal prodotto genico proteico 9.5 (PGP9.5).
   2. Deseleziona la funzione "liscia" e usa la funzione di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale nervoso, poiché è significativamente più luminoso della fluorescenza di fondo.
   3. Utilizzare la funzione di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale nervoso poiché è significativamente più luminoso della fluorescenza di fondo. Impostare un valore di soglia sufficientemente basso per identificare con precisione i nervi.
   4. Filtra le piccole superfici non nervose in base alle dimensioni.
      NOTA: Se necessario, modificare manualmente ulteriori superfici non nervose all'interno della scheda "Modifica" tenendo premuto il tasto CTRL per evidenziare più oggetti e quindi eliminandoli con il tasto Canc.
4. Isolare il segnale mitocondriale fluorescente specifico del nervo:
   1. Seleziona la scheda Modifica della superficie nervosa per visualizzare la funzione "Proprietà maschera". La superficie nervosa creata viene utilizzata per isolare i mitocondri all'interno di quei nervi lontano dai segnali mitocondriali associati ai cheratinociti.
   2. Quando il pulsante "Maschera tutto" apre una finestra "Maschera canale", scegliere il segnale rosso-fluorescente deconvoluto dal menu a discesa in "Selezione canale" per il segnale mitocondriale.
   3. Fare clic nella casella per inserire un segno di spunta nell'opzione "duplica canale prima di applicare la maschera".
   4. Fare clic sul pulsante di opzione davanti all'opzione "Costante interno/esterno" delle Impostazioni maschera e fare clic nella casella per mettere un segno di spunta nell'opzione "Imposta superficie esterna voxel su" e digitare 0.00 per il valore. Fare clic sul pulsante OK per creare il nuovo canale che rappresenta i segnali mitocondriali all'interno della superficie nervosa.
5. Crea superfici specifiche per i mitocondri:
   1. Usa lo strumento "crea superficie" per creare una superficie solida dei mitocondri dal canale fluorescente appena creato dei segnali mitocondriali specifici per nervo.
   2. Deseleziona la funzione "liscio" e seleziona la funzione "sottrazione sfondo" per impostare la soglia. Questa funzione utilizza il contrasto locale attorno al segnale mitocondriale per identificare i mitocondri dallo sfondo.
   3. Impostare il valore di soglia su un valore sufficientemente basso per identificare con precisione i mitocondri. In questo esempio, la soglia inferiore è stata impostata su 2.000 per una scala a 16 bit (65.536).
   4. Filtra le superfici mitocondriali in base alle dimensioni. In questo esempio, il limite di voxel è stato impostato su 1,0 voxel, che è il limite più basso possibile. Se necessario, modificare manualmente le superfici non mitocondri all'interno della scheda "Modifica" tenendo premuto il tasto CTRL per selezionare più oggetti e quindi eliminandoli con il tasto Canc.
      NOTA: Occasionalmente, il software creerà superfici che non sono associate a un segnale mitocondriale fluorescente distinguibile. In questi casi, è possibile rimuoverli con la scheda "Modifica".

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio confocale a scansione laser Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 software	Perkin Elmer, Waltham , MA	Versione 4.4.0	Il software Volocity viene utilizzato per l'elaborazione delle immagini
Software di analisi 3D Imaris x64{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Versione 7.7.1	Il software Imaris viene utilizzato per l'analisi delle immagini