Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.
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Articolo metodologico
Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi
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29 maggio 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Preparazione degli espianti di cervello larvale
- Creare una camera di imaging.
NOTA: La registrazione stabile richiede che gli espianti cerebrali siano legati. Qui, una camera di imaging a basso costo e fatta a mano viene utilizzata nel sistema di imaging Ca2+.- Usando una pinza, grattare il centro inferiore di una piastra di coltura di plastica (35 mm x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale, facilitando il montaggio (passaggio 1.3, Figura 1).
- Con uno stuzzicadenti, posiziona una piccola goccia di supercolla su entrambi i lati dell'ammaccatura e attacca una barra di tungsteno (diametro 0,125 mm, lunghezza da 6 a 7 mm) alla colla.
- Utilizzando un piccolo pezzo di adesivo riutilizzabile simile a uno stucco, creare una parete circolare (10 mm di diametro e 3 mm di altezza) che circonda l'ammaccatura (Figura 1).
NOTA: Lo spazio all'interno del muro sarà successivamente riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 0,14 M cloruro di sodio (NaCl), 0,0027 M cloruro di potassio (KCl), 0,01 M ione fosfato (PO43–), pH 7,4 ± 0,05 a 25 °C).
- Preparazione animale
NOTA: Per l'imaging del calcio, un indicatore di calcio, GCaMP6s, è espresso nel tipo di cellula di interesse, che si ottiene comunemente utilizzando combinazioni di GAL4 tessuto-specifico e UAS-GCaMP6s. Per garantire che il segnale sia mediato attraverso il recettore candidato, GCaMP6s è espresso anche in un mutante difettoso nel recettore.- Quando sono necessari confronti sperimentali per diversi genotipi come wild type e mutanti, l'età confronta le larve per evitare variazioni del livello di espressione di GCaMP6 e differenze fisiologiche dovute alle fasi di sviluppo.
- Tenere le mosche parentali (30 mosche per ogni sesso) in una fiala di coltura contenente cibo standard per mosche per 8 ore per consentire la deposizione delle uova sulla superficie del cibo. Allevate larve in massa in un ciclo luce-buio di 12 ore a 25 °C e 60-70 % di umidità relativa.
- Dissezione del cervello larvale
- A 90-120 ore dopo la deposizione delle uova (AEL), raccogliere le larve e lavarle almeno 3 volte con acqua distillata per rimuovere i residui di cibo aderenti.
- Posiziona una larva su un vetro quadrato da 1,5 pollici riempito di PBS ghiacciato.
NOTA: I due passaggi successivi vengono eseguiti in questo vetro di orologio sotto il microscopio da dissezione. - Usa il forcipe per afferrare delicatamente la parte centrale della larva. Usa un'altra pinza per afferrare i ganci della bocca e tira delicatamente i ganci della bocca per separare la parte anteriore della larva contenente il cervello dal resto del corpo.
NOTA: In alternativa, possono essere utilizzate le forbici chirurgiche. - Tenere la punta anteriore con una pinza e capovolgere la larva. Rimuovere il tessuto estraneo attaccato al cervello, come i dischi immaginali, i corpi adiposi e le ghiandole anulari. Separa delicatamente il cervello dall'apparato boccale.
- Applicare 200 μl di PBS all'interno dell'anello realizzato con l'adesivo riutilizzabile simile allo stucco nella camera di imaging. Aspirare delicatamente il cervello sezionato con PBS in una pipetta Pasteur, quindi trasferirlo nella camera di imaging.
- Impostazione del cervello nella camera di imaging
- Usa una pinza per afferrare le fibre muscolari che si estendono dai gangli ventrali. Inserire delicatamente il cervello nell'ammaccatura sotto il filo di tungsteno.
- Utilizzando un'altra pinza, tirare leggermente il filo di tungsteno verso l'alto per posizionare il cervello nella posizione corretta per l'imaging (Figura 1).
2. Acquisizione di immagini a fluorescenza Ca2+
NOTA: Gli espianti cerebrali immersi nella PBS vengono ripresi utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a immersione in acqua 20X (apertura numerica, N.A. = 0,5). La PBS non attiva le cellule del cervello. Se sono necessarie immagini dell'asse Z, la lente dell'obiettivo viene montata con un motore della lente attivato piezoelettricamente. Una testa confocale a disco rotante viene utilizzata per migliorare la risoluzione temporale. Per l'imaging in condizioni di scarsa illuminazione, sul microscopio è montata una fotocamera per dispositivi ad accoppiamento di carica che moltiplica gli elettroni. L'imaging della fluorescenza GCaMP6s (eccitazione/emissione: 488/509 nm) richiede un laser a 488 nm per l'eccitazione con un divisore di fascio dicroico e un filtro di emissione (e.g., 528 ± filtro passa-banda a 38 nm).
- Posizionare la camera di imaging contenente l'espiante cerebrale sotto il microscopio.
- Abbassare la lente dell'obiettivo fino a toccare il PBS. Sotto l'illuminazione a campo chiaro, posiziona il cervello e mettilo a fuoco. Passa alla luce fluorescente e regola la messa a fuoco sulle celle etichettate con GCaMP6s.
NOTA: La fluorescenza verde basale dei GCaMP6 dovrebbe essere visibile. - Avviare l'acquisizione a 250 ms/frame con una risoluzione di 512 × 512 pixel in modalità raffreddata ad acqua utilizzando il software di acquisizione appropriato (e.g., μManager). Regolare il tempo di esposizione per ottenere valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della fotocamera CCD (Charge-Coupled Device), ma non inferiori a 1000 (unità arbitrarie), con immagini a 16 bit (gamma dinamica 0-65.535).
NOTA: Un tempo di esposizione basso dovrebbe essere utilizzato per ridurre al minimo il foto-sbiancamento dei GCaMP6. Il tempo di esposizione dovrebbe essere ottimizzato in ogni esperimento in quanto dipende dai livelli di espressione di GCaMP6 e dalla sensibilità del sistema di rilevamento. Era di 100 ms nel nostro esperimento usando dilp2>GCaMP6s. Quando sono necessarie sezioni z per una data profondità di imaging, è possibile acquisire diverse immagini di sezione z a seconda del tempo di esposizione e degli intervalli di fotogrammi. Se la fotocamera ha una risoluzione spaziale sufficiente, la dimensione del binning (numero di registri sul chip che verranno raggruppati in un pixel digitale) deve essere aumentata per ridurre il tempo di esposizione. - Una volta determinati i parametri di imaging, scattare immagini per 1 minuto prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di base (F0).
- Applicare il peptide di prova; per questo, sciogliere 100 μL di soluzione peptidica in PBS e pipettarla direttamente nel bagno larvale per ottenere una concentrazione ottimale.
NOTA: La soluzione peptidica deve essere iniettata lentamente (ad es. , portata 20 μL/s) nella soluzione del bagno utilizzando una pipetta. Un peptide sintetico non correlato disciolto in PBS viene utilizzato come controllo negativo. - Registrare l'emissione di GCaMP6s per alcuni minuti.
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Risultati
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Asta di tungsteno | Sistemi A-M, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Parigi, Francia | 3049100 | Adesivi riutilizzabili simili a stucco |
| Watch glass, quadrato, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | ||
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Giappone | T900< | |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Giappone | Peptide sintetizzato da custum | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Giappone | 4372-s | |
| Nociceptin< | 4313-v | ||
| Imager Axio A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germania | Axio Imager A2 | Microscopio a fluorescenza |
| Obiettivo W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germania | 420957-9900-000< | |
| P-725 Scanner obiettivo PIFOC con lunga corsa | N/A | Spostamento lenti attivato piezoelettricamente | |
| Unità scanner confocale CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Giappone | CSU-W1 | Testina confocale a disco rotante |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Giappone | C9100-13 | Telecamera EM-CCD |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dicroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | Dicroic beam splitter |
| 528/38 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | Filtro di emissione |
| μManager | Apri Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
