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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Estrazione del cervello, sezionamento e preparazione dei tessuti
- Sacrificare il ceppo di topo wild-type C57BL/6 mediante eutanasia profonda con asfissia CO2 per 5 minuti. Assicurare la morte per lussazione cervicale.
- Pulisci la testina del mouse con etanolo al 70%.
- Eseguire la craniectomia utilizzando forbici e pinze sterili estraendo prima la pelle, iniziando dalla parte superiore della testa per esporre il cranio.
- Quindi, quando il cranio è esposto, rimuovere il cranio staccando l'osso pezzo per pezzo, partendo dal lato posteriore e spostandosi verso il lato anteriore. Fai attenzione a non distruggere i ventricoli cerebrali.
- Raccogli l'intero cervello.
- Mettere il cervello in una capsula di Petri da 100 mm contenente il Medium di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/ad alto glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/soluzione di streptomicina contenente 10.000 unità/ml di penicillina e 10.000 μg/ml di streptomicina e preriscaldata a 37 °C.
- Affettare a mano il cervello sul piano sagittale mediano con un lama affilata e utilizzare un vibratomo per ottenere la prima sezione di 100-200 mm da ciascuna metà.
- Sciacquare il tessuto cerebrale con una soluzione salina tamponata con fosfato a 37 °C (1x PBS) preriscaldata.
- Posizionare immediatamente la sezione del cervello in DMEM/terreno ad alto contenuto di glucosio preriscaldato a 37 °C.
2. Configurazione e impostazione dell'imaging dal vivo
- Posizionare le sezioni di tessuto cerebrale in piastre di coltura con fondo di vetro da 30 mm contenenti 1 ml di terreno DMEM/ad alto glucosio. Regolare l'ambiente della camera chiusa del microscopio a 37 °C, 95%/5% O2/CO2 (Figura 1}).
- Utilizzando una lente a immersione in olio per obiettivo 60X, raccogli le immagini delle cellule ependimali/ciglia posizionando una goccia d'olio sulla lente dell'obiettivo 60X e mettendo a fuoco le cellule con luce trasmessa a contrasto di interferenza differenziale (DIC) regolare.
- Quindi, segui la direzione del movimento della bolla DMEM come guida per la posizione delle ciglia ependimali mobili poiché i battiti ciliari creano una sorta di movimento della bolla nell'area. Scegli un'area contenente cellule sane con ciglia mobili nel ventricolo laterale del cervello utilizzando il filtro DIC. Una volta trovate le ciglia ependimali, regolare la luce e la messa a fuoco per ottenere un'immagine soddisfacente.
- Utilizzando il software di imaging Metamorph, impostare i parametri di imaging in tempo reale in base a uno scopo specifico. Nella presente dimostrazione, acquisisci immagini a ventiquattro bit con il binning della fotocamera impostato su 1 x 1 combinato con un obiettivo 60X e un tempo di esposizione di 5-10 msec.
- Raccogli le immagini DIC aprendo l'apertura del microscopio a un livello ottimale per un tempo di esposizione minimo. Osserva le immagini in tempo reale trasmesse alla telecamera per fornire un'acquisizione rapida e immediata delle immagini senza ritardi. Calcola la velocità di battito delle ciglia in base al requisito dei tempi di esposizione minimi per ottenere un contrasto dell'immagine sufficiente.
