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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione del tessuto cerebrale e imaging SBFSEM
- Anesteticizzare un topo nero C57 giovane (~2 - 4 mesi) (ceppo C57BL/6J) utilizzando isoflurano al 4-5% seguendo le linee guida istituzionali. Confermare l'anestesia monitorando la perdita di tono muscolare, la mancanza di movimenti volontari e le risposte a stimoli avversi come un pizzico di coda.
- Appunta il topo su un vassoio di dissezione e fai un'incisione sulla pelle lungo la linea mediana ventrale. Praticare ulteriori incisioni nella pelle per esporre la gabbia toracica del topo. Incidere il diaframma, sezionare con cura la cavità toracica lungo la periferia per esporre il cuore pulsante, quindi praticare un'incisione sull'atrio destro.
- Utilizzando una cannula a farfalla, incannulare il ventricolo sinistro. Perfondere il topo per via transcardiaca utilizzando 10 - 20 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) pH 7,2, fino a quando il dissanguamento non è confermato da un cambiamento nel colore del fegato.
Nota: Un cambiamento nel colore del fegato viene utilizzato come guida per determinare l'entità del dissanguamento. Conferma che il colore del fegato cambia da marrone rossastro a rosa pallido. - Perfondere il topo per via transcardiaca utilizzando 10-20 ml di glutaraldeide al 2% e paraformaldeide al 4% in tampone cacodilato 0,10 M (pH 7,2), per fissare rapidamente il tessuto cerebrale dall'interno. La fissazione viene monitorata osservando l'irrigidimento della coda.
Nota: Preparare un tampone cacodilato 0,10 M (pH 7,2) sciogliendo 2,14 g di cacodilato di sodio in 80 ml di acqua, aggiungere acido cloridrico per regolare il pH e portare il volume a 100 ml con acqua. - Dopo la perfusione, decapitare il topo e sezionare il cervello, seguito dalla fissazione in tampone di cacodilato di sodio 0,10 M (pH 7,2) contenente il 2% di glutaraldeide e il 4% di paraformaldeide per 48 ore a 4 oC.
- Dopo 48 ore, fare sezioni coronali di 400 μm usando un vibratomo e poi sezionare attentamente la regione di interesse nel cervello (ad esempio, l'ippocampo) al microscopio di dissezione. Taglia con cura il fazzoletto e scatta una foto per preservare l'orientamento.
Nota: I metodi di post-elaborazione della colorazione dei tessuti in SBFSEM combinano una varietà di metodi di colorazione dei metalli pesanti al fine di migliorare la risoluzione. . - Lavare i tessuti fissati con glutaraldeide 3 volte, 5 minuti ciascuno, in tampone cacodilato 0,1 M (pH 7,2).
- Preparare una soluzione di acido tannico allo 0,1% sciogliendo l'acido tannico in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,2). Agitare fino a quando non si scioglie e, se necessario, filtrare con un filtro da 0,45 μm.
- Postfissare i tessuti con acido tannico tamponato con cacodilato allo 0,1% incubando in 1 ml di reagente per 30 - 60 minuti a RT.
Nota: Il tempo di incubazione dipende dalle dimensioni del tessuto, ma 30 minuti funzionano meglio per la maggior parte dei tessuti. - Lavare i fazzoletti 3 volte, 5 minuti ciascuno, in tampone cacodilato (pH 7,2).
- Sciogliere 0,3 g di ferrocianuro di potassio e 0,86 g di cacodilato di sodio in 10 ml di H2O (dH2O). Mantenere la soluzione di ferrocianuro di potassio sul ghiaccio. Poco prima dell'uso, aggiungere 10 ml di tetrossido di osmio al 4% (OsO4).
- Colorare i fazzoletti con una soluzione di osmio-ferrocianuro al 2% per 90 minuti, con ghiaccio. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuna in dH2O.
- Preparare una soluzione di tiocarbobidrazide (TCH) all'1% sciogliendo 0,1 g di TCH in 10 ml di dH2O. Sciogliere a 60 °C agitando ogni 10 minuti fino a completa dissoluzione. Osservare le precauzioni di sicurezza durante la manipolazione di TCH, in particolare facendo attenzione a evitare l'uso di metalli, il riscaldamento ad alte temperature o l'asciugatura della soluzione.
- Trattare i campioni con TCH all'1% appena preparato per 20 minuti a RT. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuna, in dH2O.
- Diluire il 4% di OsO4 al 2% con dH2{{TAG_ 196}}O, e colorare i tessuti con tetrossido di osmio acquoso al 2% incubando per 1 ora. Lavare i fazzoletti 3 volte, 5 minuti ciascuno, con dH2O.
- Incubare i campioni O/N in acetato di uranile all'1% in dH2O a 4 °C.
- {{TAG_ Prepara la soluzione di aspartato di piombo di Walton.
- Sciogliere 0,998 g di L-aspartato in 250 ml di dH2O e quindi aggiungere 10 N di idrossido di potassio (KOH) in modo goccia fino a raggiungere il pH 5,5. Dopo la regolazione del pH, aggiungere 0,066 g di nitrato di piombo in 10 ml di brodo di acido aspartico e riscaldare a 60 °C per 30 min.
- Risciacquare i fazzoletti in dH2O e incubare con il colorante di aspartato di piombo di Walton per 30 minuti in un forno a 60 °C. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuna, in dH2O.
- Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcol utilizzando soluzioni refrigerate di etanolo al 20%, 50%, 75%, 85,% e 95% per 5 minuti ciascuna, seguito da etanolo al 100% 3 volte, 10 minuti ciascuna.
Nota: Utilizzare etanolo al 100% da bottiglie appena aperte, poiché l'etanolo aperto assorbe l'acqua dall'aria e causa il fallimento dell'incorporamento. Saranno necessarie incubazioni più lunghe con campioni di tessuto più grandi. - Lavare i campioni 2 volte, 15 minuti ciascuna, in ossido di propilene.
- Produci la resina di inclusione in plastica utilizzando 25 ml di resina, 10,5 ml di DDSA (anidride dodecenil succinica), 15,5 ml di NMA (anidride metilica nadica) e 1 ml di DMP-30 (2,4,6-Tris dimetilamminometilfenolo). Mescolare la resina agitando. Girare e lasciare riposare la resina fino a quando le bolle non si risolvono.
Nota: Questa è la ricetta standard di media durezza. Possono essere utilizzati altri tipi di resina plastica per microscopia elettronica (EM), ma devono essere testati in anticipo con un campione di controllo non essenziale poiché non tutte le resine funzionano per SBFSEM. - Incubare i tessuti O/N in una miscela 50: 50 di resina da inclusione e ossido di propilene in una fiala inizialmente tappata e aperta dopo 2 ore in modo che l'ossido di propilene evapori in un periodo di circa 8 - 10 ore.
- Trasferire i tessuti in resina da inclusione fresca al 100% in fiale pulite per 2 ore.
{{TAG_ 306}}Incorporare i campioni in resina fresca da inclusione, in stampi piatti contenenti etichette di carta stampata, e indurirli in forno a 60 °C per 48 ore. Dopo circa 1 ora, controllare nuovamente il posizionamento e l'allineamento dei tessuti e regolare se necessario. - Taglia i campioni nell'area di interesse e montali su un perno di alluminio utilizzando una supercolla cianoacrilica gelificante o una resina epossidica conduttiva. Quindi, rivestire i lati del blocco con pasta d'argento colloidale per fornire un percorso conduttivo al perno di alluminio.
- Esamina i campioni di tessuto utilizzando un sistema di microscopio elettronico a scansione dotato di un tavolino ultramicrotomo in camera e di un rivelatore di elettroni retrodiffusi a basso kV.
Nota: Ottieni una formazione sullo strumento e sul sito nell'uso della microscopia elettronica a scansione (SEM) e diventa un utente autorizzato. In alternativa, può essere possibile la collaborazione con un ricercatore o una struttura centrale per piccoli progetti. Potrebbe anche essere necessario un addestramento alle radiazioni poiché i SEM generano raggi X. - Per visualizzare i campioni, utilizzare le seguenti impostazioni: 2,25 kV, con risoluzione di 5 - 10 nm/pixel, con dimensioni di campo comprese tra 80 e 250 μm in x,y (sono possibili altre dimensioni di campo) e spessore della fetta di 50 - 100 nm, con un totale di 250 - 600 fette in un periodo di tempo di 16 - 20 ore.
Nota: Le impostazioni variano sostanzialmente tra i diversi microscopi, i singoli campioni e la risoluzione desiderata. Queste impostazioni dovrebbero produrre immagini facilmente interpretabili per molti campioni.
2. Analisi del set di dati di imaging
Nota: Il software Image J/Fiji viene utilizzato per analizzare il set di dati e si basa sul plug-in TrakEM2. Le fasi di pre-elaborazione possono essere eseguite utilizzando una varietà di software e possono essere estese o minori a seconda del livello di esperienza e degli stack ottenuti. Le principali trasformazioni che hanno portato all'uso del software open-source (ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015) sono descritte qui.
- Converti le immagini in formato tiff a 8 bit dalle immagini originali proprietarie a 16 bit aprendo il software e selezionando le voci di menu Immagine→Tipo→8 bit.
- Se la conversione automatica di contrasto/luminosità durante questo passaggio non è ideale per le immagini, riaprire le immagini a 16 bit e premere Immagine→Regola→Luminosità/Contrasto. Selezionare un intervallo che funzioni per tutte le immagini e premere Applica. Quindi eseguire la conversione. Nota: Su alcuni SEM, questo passaggio potrebbe richiedere il software del produttore del microscopio.
- Se necessario, a causa di un movimento inaccettabile dell'immagine tra le sezioni (ad esempio. deriva dovuta alla ricarica), registrare/allineare le pile di immagini (voci di menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). Nella maggior parte dei software di registrazione, impostare la modalità "solo traslazione" piuttosto che "corpo rigido".
Nota: Molti approcci e software possono funzionare: il plug-in di registrazione SIFT funziona per molte applicazioni e c'è una versione virtual stack. - Se necessario, ingrandire le dimensioni dell'area di lavoro prima della registrazione (Immagine→Regolazione→Dimensioni dell'area di disegno) o ridurle a un'area di interesse (Immagine→Ritaglio).
Nota: Potrebbe verificarsi qualche deriva o sbandamento, e provare altri plugin o software potrebbe produrre risultati migliori. Sono disponibili anche opzioni manuali (, ad esempio . ImageJ/FIJI, Plugins→Registration→ManualLandmarkSelection).
- Se lo si desidera, ridimensionare le immagini a una dimensione più piccola e gestibile (ad esempio. 25%) utilizzando ImageJ (Image→Scale).