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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.
1. Preparazione del tessuto retinico (2 ore)
NOTA: Tutte le procedure descritte in questa sezione devono essere eseguite in condizioni di scarsa illuminazione rossa
- {{}}Animali che si adattano al buio per almeno 1 ora prima della dissezione. Eseguire tutte le procedure in condizioni di scarsa illuminazione rossa.
- Eutanasia degli animali mediante asfissia da CO2 ed enucleare i bulbi oculari in una capsula di Petri con soluzione extracellulare precedentemente ossigenata.
- Colpisci la cornea con un ago e tagliala tagliandola con le forbici oftalmiche al bordo della cornea e della sclera.
- Rimuovere la lente usando una pinza #5. Fai delicatamente una lacerazione nella sclera con il forcipe e recidi il nervo ottico dove la retina e la sclera si incontrano. Termina con cura la rimozione della sclera dalla retina.
- Rimuovere il vitreo trasparente usando una pinza #5; Una volta rimosso, il vitreo si presenta come una sostanza gelatinosa attaccata alla pinza. Tagliare le retine a metà (in modo che ci siano 4 pezzi/animale) e conservarle in soluzione extracellulare ossigenata a RT fino al momento dell'uso.
- Quando è pronto per montare il tessuto nella camera di registrazione, posizionare un pezzo di retina per incubare in una soluzione enzimatica diluita in 500 μL di soluzione extracellulare ossigenata. Incubare in una capsula di Petri per 2 minuti a temperatura ambiente (RT) su uno shaker.
- Lavare il pezzo di retina in una soluzione extracellulare ossigenata e posizionare il tessuto in una camera di registrazione con fondo di vetro; Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata per consentire il trasferimento della retina senza causare danni al tessuto.
- Usa una pinza per appiattire con cura il tessuto con lo strato di fotorecettori rivolto verso il basso. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pipetta. Ancorare il tessuto utilizzando un anello di platino con rete di nylon.
NOTA: Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per preparare il tessuto per l'isolamento dell'RNA da cellule amacrine e bipolari marcate. - Riempire la camera con una soluzione extracellulare ossigenata e montarla su un tavolino da microscopio. Perfondere il tessuto con soluzione extracellulare ossigenata a 2-4 mL/min.
3. Visualizzazione e targeting delle cellule gangliari retiniche GFP+ (10 min)
NOTA: Tutte le procedure in questa sezione devono essere eseguite in condizioni di scarsa illuminazione rossa
- Prima di iniziare, estrarre micropipette in vetro (diametro esterno [OD]: 1,2 mm, diametro interno [ID]: 0,69 mm) per registrazioni elettrofisiologiche utilizzando un estrattore per micropipette. Utilizzare il seguente protocollo per gli elettrodi (si prega di notare che i parametri devono essere regolati di conseguenza per ottenere la resistenza desiderata e varieranno tra gli estrattori e con vetro diverso): Calore: Rampa +10; Tiro: 0; Vel: 23; Ritardo: 1; Pressione: 500; Ciclo di programma: 5 volte. Assicurarsi che le punte abbiano un diametro di ~1 μm, con resistenze di 2-4 MΩ per il targeting di celle grandi e di 5-7 MΩ per il targeting di celle più piccole.
- Osservare lo strato di cellule gangliari utilizzando l'ottica IR-DIC (Infrared Differential Interference Contrast) (Figura 1A). Identificare la proteina fluorescente verde (GFP)+ le cellule gangliari retiniche (RGC) utilizzando l'epifluorescenza (~480 nm) (Figura 1B).
- Individuare la pipetta riempita con soluzione intracellulare in DIC. Applicare una leggera pressione positiva e zero voltage offset sull'amplificatore.
- Premere la micropipetta di vetro contro una cella GFP+ e applicare una pressione negativa per formare una tenuta GΩ tra la pipetta e la membrana cellulare. Applicare i passaggi del comando di tensione di prova (, ad esempio, 5 mV) per monitorare la resistenza di tenuta. Dopo aver formato una tenuta stabile, rompere la membrana applicando brevi impulsi di pressione negativa per ottenere l'accesso all'intera cellula.
- Attendere 1-2 minuti affinché i dendriti della cellula si riempiano di tracciante fluorescente.
NOTA: La cellula può essere tipizzata morfologicamente esaminando la morfologia in epifluorescenza (Figura 1C). Nel caso di RGC che esprimono melanopsina, la stratificazione dendritica nello strato plessiforme interno viene visualizzata esaminando i dendriti riempiti con tracciante fluorescente sotto illuminazione epifluorescente e determinando se si stratificano lontano dal soma nella sottolamina OFF (ipRGC M1), vicino allo strato di cellule gangliari nella sottolamina ON (ipRGC M2 e M4) o entrambi (ipRGC M3). Questa osservazione, combinata con la dimensione del soma (gli M4 hanno soma distintamente grandi rispetto a tutti gli altri sottotipi di ipRGC), consente l'identificazione del tipo di cellula. Pertanto, questa tecnica consente l'identificazione del tipo di cellula in vitro prima dell'isolamento dell'RNA. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri protocolli di identificazione del tipo di cellula che coinvolgono la morfologia dendritica o la fisiologia cellulare.
