Imaging di fotoattivazione a fluorescenza del trasporto di neurofilamenti negli assoni di topo mielinizzati

Abstract

Fonte: Boyer, N. P. et. al., Imaging e analisi del trasporto di neurofilamenti nel nervo tibiale di topo asportato. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra il metodo di fotoattivazione della fluorescenza da analizzare Trasporto di neurofilamenti negli assoni mielinizzati dei nervi periferici. Tracciando i neurofilamenti verdi fotoattivati marcati con fluorofori, la tecnica fornisce informazioni sul trasporto assonale nelle malattie neurodegenerative.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della soluzione salina nervosa

1. Produrre 100 mL di soluzione salina di Breuer: 98 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1 mM di cloruro di potassio (KCl), 2 mM di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄), 1 mM di solfato di magnesio (MgSO₄), 1,5 mM di cloruro di calcio (CaCl₂), 5,6% di D-glucosio, 23,8 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) in acqua bidistillata.
2. Far bollire il 95% di ossigeno/5% di anidride carbonica (carbogeno) attraverso la soluzione salina per almeno 30 minuti prima dell'uso. La soluzione salina avanzata può essere riutilizzata entro una settimana; Tuttavia, deve essere riossigenato prima di ogni utilizzo.
3. Versare la soluzione fisiologica ossigenata in una siringa da 60 ml e assicurarsi che la quantità minima di aria rimasta rimanga nella siringa.

2. Assemblaggio iniziale della camera di perfusione nervosa

1. Collegare la siringa e il tubo come mostrato in Figura 1A, posizionando il tubo di deflusso in un pallone di scarico.
2. Posizionare la guarnizione esterna nell'alloggiamento della camera di perfusione, assicurandosi che i poli di ingresso e uscita del flusso siano allineati con i fori della guarnizione.
3. Appoggiare la guarnizione interna (silicone, spessore 100 μm) su un vetrino coprioggetti circolare #1,5 (diametro 40 mm), levigando accuratamente eventuali pieghe nella guarnizione per garantire una tenuta ermetica. Per facilitare il montaggio successivo, posizionare il vetrino coprioggetti e la guarnizione su un tovagliolo di carta o pulire con la guarnizione rivolta verso l'alto.

3. Dissezione e preparazione del nervo tibiale di topo

1. Sacrificare l'animale mediante inalazione di anidride carbonica o un altro metodo istituzionalmente approvato. Avvia un timer quando l'animale smette di muoversi/respirare, poiché gli esperimenti devono essere condotti solo entro 3 ore dal sacrificio.
2. Spruzzare il pelo con etanolo al 70% e rimuoverne il più possibile dalle zampe e dalla schiena dell'animale utilizzando un rasoio elettrico.
3. Usando un paio di grandi forbici da dissezione, praticare un'incisione dorsale nella pelle vicino al centro della colonna vertebrale e continuare il taglio attorno all'aspetto ventrale dell'animale. Partendo da questo taglio, riflettere lentamente la pelle dalle gambe tirandola delicatamente lontano dal muscolo e tagliando la fascia.
4. Posizionare l'animale in posizione supina su un vassoio di dissezione e bloccare tutte e quattro le zampe. Opzionalmente bloccare la coda per ridurre ulteriormente il movimento.
5. Usando le forbici da microdissezione, praticare un'incisione nei muscoli della coscia a metà strada tra la coda e il ginocchio per esporre il nervo sciatico. Assicurarsi che il nervo, che è visibile attraverso il muscolo, non sia tagliato.
6. Estendere l'incisione dorsalmente e ventralmente per rimuovere il muscolo. Allo stesso modo, rimuovere i muscoli del polpaccio, mantenendo i tagli poco profondi e corti per evitare di danneggiare i nervi.
7. Rimuovere i muscoli fino a quando il nervo tibiale non è completamente esposto dal punto in cui si dirama dal nervo sciatico (al ginocchio) al tallone (Figura 2A).
   NOTA: In tutte le fasi, inclusa e successiva alla dissezione del nervo tibiale, evitare l'esposizione non necessaria alla luce ambientale per ridurre al minimo la possibile attivazione accidentale della proteina fluorescente verde fotoattivabile (paGFP) nel nervo.
8. Afferrare il nervo tibiale all'estremità spinale-prossimale con un paio di pinze e tagliare il nervo usando un paio di forbici da microdissezione. Facendo attenzione a non mettere in tensione il nervo, sollevarlo dal muscolo, tagliando eventuali attacchi.
9. Tagliare l'estremità spinale-distale del nervo tibiale e trasferirla in una piccola capsula di Petri di soluzione fisiologica ossigenata a temperatura ambiente. Da questo punto in poi della procedura, assicurati sempre di tenere traccia delle estremità prossimale e distale del nervo.
   NOTA: Un modo per farlo è quello di segnare l'estremità distale del nervo con un taglio angolato in modo tale che la conicità sia visibile.
10. Partendo dall'estremità prossimale del nervo, afferra delicatamente le estremità dell'assone esposte con un paio di pinze a punta molto fine.
11. Con un secondo paio di pinze, afferrare la guaina nervosa prossimalmente e tirare lentamente verso l'estremità distale del nervo. La guaina nervosa scivolerà lungo gli assoni con una resistenza minima. Assicurarsi che non venga applicata una tensione eccessiva al nervo durante questo processo.

4. Assemblaggio finale della camera di perfusione nervosa

1. Afferrando l'estremità prossimale del nervo, rimuoverlo dalla soluzione salina e adagiarlo lentamente sul vetrino coprioggetti della camera di perfusione all'interno dell'apertura rettangolare della guarnizione interna, mantenendo una leggera tensione sul nervo mentre lo si appoggia in modo che sia dritto.
2. Posizionare il vetrino del microacquedotto sul nervo con il lato scanalato rivolto verso il nervo e la direzione del flusso parallela al nervo. Capovolgere il vetrino coprioggetti e il gruppo del microacquedotto e posizionarlo all'interno dell'alloggiamento della camera di perfusione con il vetrino del microacquedotto posizionato sulla guarnizione esterna. Il nervo e la guarnizione interna circostante saranno ora inseriti tra il vetrino coprioggetti e il vetrino del microacquedotto, che sono separati dalla guarnizione, con il vetrino coprioggetti rivolto verso l'alto (Figura 1B).
3. Fissare la camera di perfusione posizionandola nell'alloggiamento metallico e ruotando l'anello di bloccaggio. Assicurarsi che l'alloggiamento in plastica sia completamente sotto tutte le clip metalliche e serrare bene per evitare perdite di soluzione salina. Un serraggio eccessivo può rompere la slitta del microacquedotto o il vetrino coprioggetti. Capovolgere la camera in modo che il vetrino coprioggetti sia rivolto verso il basso.
4. Premere lentamente lo stantuffo della siringa con soluzione fisiologica per riempire la camera di perfusione. Durante l'installazione e l'imaging, tenere sempre il tubo di ingresso e di uscita, il pallone di uscita e la siringa sollevati sopra la camera stessa durante l'installazione e l'imaging. In questo modo si evita il sifonamento, che può introdurre bolle o causare instabilità della messa a fuoco a causa della pressione negativa nella camera.
5. Trasferire il gruppo di perfusione su un tavolino per microscopio invertito e montare la siringa salina nella pompa a siringa. Avviare il motore a una velocità appropriata per una portata di 0,25 mL/min. Quindi collegare e accendere il riscaldatore della soluzione in linea impostato a 37 °C.
6. Collegare il riscaldatore dell'obiettivo e impostarlo a 37 °C, applicare olio all'obiettivo e inserire la camera di perfusione nel supporto del tavolino.
7. Applicare olio sul cuscinetto del riscaldatore della camera e fissarlo alla camera di perfusione. Collegare e accendere il riscaldatore della camera; impostato a 37 °C.
   NOTA: Le variazioni di temperatura possono causare la formazione di bolle nella camera di perfusione a causa del degassamento della soluzione. Se si formano bolle, aumentare brevemente la portata della soluzione di 5-10 volte fino a quando le bolle non liberano la camera.
8. Bloccare la camera di perfusione nell'adattatore del tavolino e portare l'olio dell'obiettivo a contatto con il vetrino coprioggetti sul lato inferiore della camera.
   NOTA: La camera Bioptechs con adattatore per stadio ASI utilizzata qui è progettata per una configurazione di microscopio invertito.

5. Attivazione della fluorescenza e acquisizione dell'immagine

1. Utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, concentrarsi sullo strato di assoni sulla superficie inferiore del nervo più vicino alla superficie del vetrino coprioggetti (Figura 2B). Gli assoni mielinizzati (tipicamente di diametro 1-6 μm nei topi adulti) possono essere identificati dalla presenza di una guaina mielinica, visibile in condizioni di illuminazione a luce trasmessa in campo chiaro senza aumento del contrasto. Anche le fessure di Schmidt-Lanterman e i nodi di Ranvier sono facilmente evidenti. Gli assoni non mielinizzati sono più sottili (tipicamente <1 μm di diametro) e sono generalmente presenti in fasci (fasci Remak), dove sono generalmente troppo vicini per essere risolti l'uno dall'altro.
2. Se disponibile sul microscopio, attivare il sistema di messa a fuoco automatica per mantenere la messa a fuoco nel corso dell'imaging time-lapse.
3. Acquisire un'immagine di riferimento in campo chiaro. Registrare l'orientamento del nervo (estremità spinale-prossimale e distale) rispetto alle immagini.
4. Acquisire un'immagine confocale utilizzando un laser a 488 nm e un filtro di emissione appropriato per la paGFP (ad esempio, 525/50 nm) per registrare l'autofluorescenza pre-bleach. Mantenere bassa la potenza del laser per ridurre al minimo il fotosbiancamento, con il tempo di esposizione regolato di conseguenza per rilevare il segnale debole. Ad esempio, sono stati acquisiti dati rappresentativi al 5% di potenza laser e 4 s di esposizione. Registrare le impostazioni di acquisizione per utilizzarle in tutti gli esperimenti futuri.
   NOTA: Dopo la fotoattivazione, le impostazioni di imaging ideali produrranno un rapporto segnale/rumore > 8 e un photobleaching inferiore al 25% del segnale originale nel corso di 20 immagini. Gli assoni possono anche essere ripresi con la microscopia a epifluorescenza a campo largo come abbiamo fatto in origine, ma la qualità dell'immagine sarà inferiore a causa della mancanza di confocalità.
5. Impostare la potenza del laser su una potenza di imaging circa 5 volte superiore alla normale e acquisire un'immagine con un tempo di esposizione di 3-4 minuti. Sebbene non sia essenziale, questo passaggio è consigliato per sbiancare l'autofluorescenza e altre fonti di fluorescenza indesiderata al fine di ridurre il segnale di fondo e quindi massimizzare il rapporto segnale/rumore della fluorescenza fotoattivata.
6. Acquisire un'immagine con le impostazioni utilizzate nel passaggio 5.4 per registrare l'autofluorescenza pre-attivazione dopo questa fase di sbiancamento.
7. Sull'immagine in campo chiaro, tracciare una linea parallela agli assoni con una lunghezza uguale alla dimensione della finestra di attivazione desiderata. La lunghezza di questa finestra varierà a seconda dell'obiettivo sperimentale e dei parametri, ma le lunghezze tipiche sono di 5 μm per il paradigma di fuga dell'impulso e di 40 μm per il paradigma di diffusione dell'impulso.
8. Utilizzando questa linea come guida, disegnare una regione di interesse rettangolare (ROI) attraverso il campo visivo perpendicolare agli assoni. La regione deve comprendere tutti gli assoni per essere fotoattivata.
9. Determinare le impostazioni ottimali per la fotoattivazione con illuminazione a 405 nm.
   NOTA: Esegui questo passaggio e i passaggi secondari solo prima della prima attivazione sperimentale. Nel corso di un esperimento, devono essere utilizzate le stesse impostazioni di fotoattivazione.
   1. Attiva ripetutamente una regione di interesse utilizzando la linea laser a 405 nm, la bassa potenza del laser (ad esempio, 5%) e il tempo di permanenza dei pixel (ad esempio, 40 μs) e un impulso, acquisendo un'immagine della proteina fluorescente verde attivata o della fluorescenza GFP dopo ogni attivazione. Ripetere l'operazione fino a quando la fluorescenza non aumenta più, quindi quantificare la fluorescenza in una regione di interesse per ogni immagine.
   2. Traccia le intensità medie di fluorescenza rispetto al numero di impulsi. Selezionare il numero di impulsi dopo i quali la fluorescenza non aumenta più come numero ottimale di impulsi per l'attivazione.
10. Attivare la fluorescenza paGFP nella regione disegnata al punto 5.8 mediante eccitazione modellata con luce a 405 nm. Assicurarsi che un'immagine venga acquisita appena prima e subito dopo l'attivazione.
    NOTA: L'attivazione ideale di paGFP produrrà una regione di fluorescenza chiaramente definita con confini netti contenuti all'interno della regione di interesse o ROI.
11. Avvia un timer di 1 minuto al termine dell'attivazione. Al termine di 1 minuto, inizia l'acquisizione di una serie timelapse.
    NOTA: Il ritardo di 1 minuto è necessario per consentire l'aumento della fluorescenza che si osserva in seguito alla fotoattivazione della paGFP. Per il metodo pulse-spread, un periodo di acquisizione di 5-10 minuti con intervalli timelapse di 30 secondi è sufficiente per la misurazione delle pendenze iniziali nelle finestre centrale e fiancheggiante per misurare la velocità e la direzionalità. Per il metodo pulse-escape, un periodo di acquisizione di 30-150 minuti con intervalli timelapse di 5 o 10 minuti consente l'analisi del comportamento di pausa a lungo termine dei filamenti.
12. Salva tutte le immagini acquisite, nonché il ROI utilizzato per l'attivazione della fluorescenza.
13. Spostati in una nuova regione del nervo e ripeti i passaggi 5.1-5.11. Se la nuova regione si trova lungo lo stesso assone, deve trovarsi ad almeno 500 μm dalla regione precedentemente attivata per evitare il rilevamento di neurofilamenti fluorescenti che si sono spostati dall'altra regione attivata. L'acquisizione del timelapse finale deve terminare prima della fine della finestra di 3 ore.
    NOTA: È possibile che la preparazione possa essere praticabile per più di 3 ore, ma non lo abbiamo confermato. Con una dissezione e una preparazione competenti, è possibile acquisire da cinque a otto set di immagini timelapse di 10 minuti entro questa finestra di 3 ore.
14. Dopo aver acquisito la serie di immagini timelapse finale, arrestare il flusso di soluzione fisiologica, scollegare la soluzione e i riscaldatori della camera e rimuovere l'apparato di perfusione dal tavolino del microscopio.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
14 x 22 Guarnizione rettangolare 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Guarnizione interna
2-deossi-D-glucosio	Sigma	D6134
30mm Guarnizione rotonda con fori	Bioptechs	1907-08-750<
35 x 10mm piatto	Thermo Fisher	153066	Piatti di dissezione
Vetrini coprioggetti rotondi da 40 mm	Bioptechs	40-1313-0319
siringa da 60mL - Punta Luer-lock	BD	309653
Andor Revolution WD sistema confocale a disco rotante	Andor		Dotato di Perfect Focus e sistemi FRAPPA
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	Per diapositiva di fluoresceina
D-(+)-soluzione di glucosio	Sigma	G8769
Perno di dissezione	Strumenti scientifici	26001-70
Pinze di dissezione	Strumenti scientifici	11251-30	Pinze a punta fine
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Piatto di dissezione con cera	Ginsberg Scientific	568859
Forbici da dissezione	Strumenti scientifici	14061-09	Dissezione iniziale forbici
Camera di perfusione FCS2	Bioptechs	60319-02-03
Fluoresceina sodica	Fluka	46960
Riscaldatore soluzione in linea	Warner Instruments	SH27-B
pinza per laminectomia	Strumenti scientifici	11223-20	Pinze per dissezione iniziale
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Diapositiva del microacquedotto	Bioptechs	130119-5
Vetrini per microscopio	Fisher	12-544-3	Per diapositiva fluorescente
Inserto per tavolino da microscopio	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch con collare obiettivo
Olio obiettivo - tipo A	Nikon	discontinued
Obiettivo Plan Apo VC 100x 1.40 NA	Nikon	MRD01901
Cloruro di potassio	Fisher	P217
Fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P0662
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6297
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Pompa siringa	Sage Instruments	Modello 355
Adattatore per tubi - femmina	Small Parts Inc.	1005109
Adattatore per tubi - maschio	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" spessore della parete<
Forbici a molla Vannas	Strumenti di Fine Science	15018-10	forbici fini

td style='colore di sfondo:#ffffff;colore:#1a202c;famiglia-carattere:Arial;dimensione-carattere:10pt;peso-carattere:normale;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;spazio-bianco:normale;word-wrap:break-word;strategia-wrap:4;;'>Guarnizione esternatr style='altezza:21px;'>