Microscopia a due fotoni per l'imaging della morfologia neuronale in un cucciolo di topo

Abstract

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imaging a due fotoni dei neuroni corticali nei topi neonatali. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la microscopia a due fotoni utilizzata per visualizzare i neuroni nel cervello di un cucciolo di topo transgenico anestetizzato. Il laser a due fotoni consente immagini più approfondite con un'elevata risoluzione spaziale e una dispersione della luce minima, consentendo l'acquisizione dettagliata della morfologia neuronale, comprese le proiezioni dendritiche.

Protocollo

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p style='altezza-linea:1.2;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'>Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal veterinario JoVE scheda di revisione.

1. Preparazione della finestra cranica

1. Anestetizzare il cucciolo usando isoflurano (1,0% - 2,0%) e controllare il livello di anestesia con un test di pizzicamento della coda.
2. Apri con cura il cranio con una lama di rasoio sterilizzata lasciando intatta la dura madre (1 mm di diametro) (Figure 1C). Utilizzare una spugna di gelatina (tagliata in piccoli pezzi, circa < 2 mm3, usando forbici sterilizzate, e applicarle con una pinzetta) imbevuta di tampone cortex (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glucosio, 10 mmol/L HEPES (acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico), 2 mmol/L CaCl₂, e 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) per fermare l'emorragia. Quando si apre il cranio, applicare un tampone di corteccia per mantenere umida la superficie del cervello.
3. Utilizzando una spugna di gelatina, rimuovere eventuali tamponi e sangue dalla superficie durale. Utilizzando le punte gialle, applicare uno strato sottile di agarosio a basso punto di fusione all'1,0% (disciolto nel tampone della corteccia). Utilizzando una macchina a blocchi termici, mantenere la temperatura della soluzione di agarosio a 42°C fino all'applicazione.
   NOTA: Il drenaggio del tampone e del sangue deve essere eseguito dal lato della craniotomia facendo attenzione che la spugna di gelatina secca non venga a contatto con la dura. In caso contrario, la dura madre potrebbe danneggiarsi.
4. Applicare un vetrino coprioggetti rotondo in vetro (n. 1, 3 mm di diametro) sullo strato di gel di agarosio. Rimuovere tutte le bolle tra il vetrino coprioggetti e lo strato di gel di agarosio versando un eccesso di gel di agarosio tra di loro. Rimuovi il gel in eccesso che sporge da sotto il vetrino coprioggetti usando una pinzetta (Figura 1D e1E).
5. Fissare il vetrino coprioggetti utilizzando il cemento dentale (Figura 1F).
6. Mescolare la polvere di cemento e il liquido di cemento. Applicare il composto utilizzando le punte gialle prima che si solidifichi. Non applicare cemento dentale sulla dura, perché ciò potrebbe danneggiare il cervello.
7. Attacca una barra di titanio sterile (su misura, circa 30 mg, vedi Figura 1G) sull'osso cranico utilizzando cemento dentale. Allineare la barra di titanio e il vetrino coprioggetti (sulla superficie della dura) in parallelo per acquisire facilmente le immagini.
8. Copri il cranio esposto con cemento dentale (Figura 1H).
9. Recupera il cucciolo dall'anestesia. Tenerlo acceso su un riscaldatore (37 °C) fino a quando il cemento dentale non si è solidificato (1 ora).

2. Imaging a due fotoni

1. Impostare la lunghezza d'onda del laser a due fotoni. Per l'eccitazione RFP (proteina fluorescente rossa), utilizzare 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 μm di profondità).
   NOTA: La potenza del laser dovrebbe essere ridotto man mano che la posizione z si sposta verso l'alto.
2. Pulire la superficie del vetrino coprioggetti con etanolo al 70%.
3. Anestetizzare il cucciolo con isoflurano (1,5% - 2,0%) e controllare il livello di anestesia utilizzando un test di pizzicamento della coda.
4. Attacca il cucciolo alla piastra di titanio sullo stadio di imaging usando una barra di titanio sulla testa del cucciolo (Figura 2A e 2B). Regolare la testa in modo che il vetrino coprioggetti sia parallelo alla lente dell'obiettivo utilizzando il tavolino goniometrico (Figura 2B). Mantenere la temperatura corporea del cucciolo utilizzando un termoforo (37 °C).
5. Impostare la concentrazione di isoflurano allo 0,7% - 1,0%.
   NOTA: Una concentrazione molto elevata di isoflurano può causare la morte accidentale del cucciolo durante l'imaging.
6. Posiziona lo stadio di imaging sotto la lente dell'obiettivo (20X, NA 1.0) del microscopio a due fotoni (Figura 2B e 2C).
7. Applicare una goccia d'acqua sul vetrino coprioggetti. Utilizzare l'epifluorescenza per localizzare i neuroni marcati con proteine fluorescenti nell'area in cui è stata esposta la dura madre.
8. Acquisizione di immagini z-stack a intervalli di 1,4 μm. Per l'imaging dei neuroni di livello 4, imposta la larghezza z a 150 - 300 μm per visualizzare l'intera morfologia dendritica (Figura 2D e 2E). Utilizzare la scansione lenta e la media per ottenere immagini chiare che mostrino la morfologia neuronale (di solito ci vogliono > 20 minuti per acquisire l'intera morfologia dendritica).
   NOTA: Per l'imaging si consigliano i seguenti parametri. Lunghezza d'onda di eccitazione: 1.000 nm, scanner: tipo galvanometro, specchio dicroico: 690 nm, filtro di emissione: 575 - 620 nm passa-banda, rivelatore: tipo GaAsP, impostazione del guadagno > 100, dimensione dell'immagine > 512 x 512 μm, campo visivo > 600 x 600 μm, risoluzione pixel < 1,2 μm.

Risultati

Figura 1: Chirurgia, preparazione della finestra cranica e fissaggio della barra di titanio. (A) Questo pan...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti pK031. TRE-CreAutori-Disponibile da RIKEN BRC e AddgenepK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPREAutori-Disponibile da RIKEN BRC e AddgenepK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPREAutori-Disponibile da authorsIsofluranoWako099-06571 410 Unità di anestesia (macchina a gas isoflurano)Univentor8323101 Vetbond (adesivo per tessuti)3M084-1469SB MμltiFlex Round (suggerimento di caricamento)Sorenson13810 Gelfoam (spugna di gelatina)Pfizer09-0353-01 AgaroseSigmaA9793Punto di fusione bassoVetrino coprioggetti di forma rotondaMatsunami-Custom madeUnifast 2 (cemento dentale)GC- barra di titanioAutori-Su misura (vedi Figura 1G)Rimadyl (carprofen)Zoetis-Injectablemicroscopio a 2 fotoniZeissLSM7MP Laser titanio-zaffiroSpertra-PhysicsMai-Tai eHPDS Piastra in titanioAutori-Realizzato su misura (vedi Figura 2A)IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE Goniometro stageThorlabsGN2/M