Imaging a bioluminescenza per lo studio dei transitori di calcio nelle strutture cerebrali di Drosophila

Abstract

<

p style='altezza-linea:1.38;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'>Fonte: Lark, A. R., et. al., approccio di imaging cerebrale funzionale in vivo basato sull'indicatore di calcio bioluminescente GFP-aequorina. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'imaging in tempo reale della dinamica del calcio utilizzando la bioluminescenza fluorescente della proteina-equorina verde in Drosophila'sstrutture cerebrali profonde.

Protocollo

1. Imaging

1. Setup
   1. Avviare il sistema di registrazione accendendo il microscopio, il computer, la telecamera e il sistema di drenaggio e impostando i controlli ambientali della stanza a 25 °C.
   2. Aprire la misurazione e Programma Automation Explorer sul computer. Fare clic su "Devices and Interfaces", quindi fare doppio clic su "NI Motion Devices" e infine fare clic con il pulsante destro del mouse su "PCI-7334" e selezionare "initialize device".
   3. Aprire Photon Imager. Crea una nuova cartella e assegna un nome al primo file di registrazione. La telecamera deve raggiungere i -80 °C prima che il sistema funzioni.
   4. Impostare il sistema di perfusione: aggiungere KCl (cloruro di potassio), nicotina e soluzione di Ringer ai serbatoi e regolare in modo che ogni soluzione si scarichi a 2 ml/min. Lavare con la soluzione di Ringer prima di iniziare l'esperimento.
2. Preparare il campione
   1. Posizionare il blocco di imaging sulla montatura sotto un microscopio a ingrandimento 5X e inserire il tubo di perfusione nel canale attraverso la puntura.
   2. Impostare il microscopio in modalità fluorescente, quindi centrare e mettere a fuoco i corpi a fungo (MB). Regola su 20X, ricentra e metti a fuoco.
   3. Posizionare l'apparato di drenaggio sopra la piscina di drenaggio, regolare l'altezza dello shunt di drenaggio in modo che la punta sia appena sopra la piscina ed eseguire la soluzione di Ringer per 30 secondi per garantire un drenaggio adeguato.
   4. Abbassare lo schermo per proteggere l'apparecchio dalla luce. Utilizzando il sistema automatizzato dell'imager a fotoni, effettuare regolazioni precise della messa a fuoco e scattare un'immagine fluorescente di riferimento dei MB.
3. 1. Regolare la velocità dei fotoni alla velocità di registrazione desiderata (da 50 msec fino a 1 sec o più). Seleziona la modalità fotone e apri l'otturatore. Registra il genotipo, il sesso, l'età e il numero di campioni nelle voci di registro. Regola la posizione delle caselle ROI (Region of interest) sul calice e sui corpi cellulari (CCB) e sui lobi mediali facendo clic sulle caselle ROI e trascinando tenendo premuto il controllo.
   2. Registrare il basale per circa 5-10 minuti (come desiderato).
   3. Applicare la nicotina per 1 minuto. Annotare l'avvio/l'arresto nel registro. Lavare con la soluzione di Ringer per 5 minuti.
   4. Attendere 5 minuti per il recupero e preparare la voce del registro KCl (cloruro di potassio) e il timer.
   5. Applicare KCl per 1 min. Annotare l'avvio/l'arresto nel registro. Lavare con la soluzione di Ringer per 1 minuto.
   6. Passare alla modalità fluorescente, scattare l'immagine fluorescente finale e spegnere la soluzione di Ringer.
   7. Premi "Stop". Una finestra di dialogo ti chiederà se desideri spegnere il sistema. Seleziona "No" per continuare la registrazione.
   8. Aprire lo schermo, spostare il sistema di drenaggio, impostare l'obiettivo della lente su 5X e rimuovere il tubo di perfusione. Rimuovere il campionatore/piatto di registrazione dal tavolino e pulire l'obiettivo 20X risciacquando e strofinando l'obiettivo due volte con acqua.
   9. Premere il pulsante bianco di riproduzione nella parte superiore della finestra del programma per avviare la registrazione successiva.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Sodium chlorideSigma-AldrichS3014 Calcium chlorideMerck1023911000 HEPESSigma-Aldrich7365-45-9 Cloruro di potassioProlabo26 764.298 Cloruro di magnesioProlabo25 108.295 SucroseSigma-AldrichS0389 NicotinaSigma-AldrichN3876 ATPSigma-AldrichA2383Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idratoBenzyl-coelenterazine<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Prolume, nanolightCat #301 Celenterazina hhttp://www.prolume.com/Puntali per pipetteCorning Incorporated4868100-1000μL Univesal Pipette TipEM-CCD cameraAndorDU-897E-CS0-#BViXon (raffreddato a -80°C)MicroscopeNikonN/AEclipse-E800Obiettivo a immersioneNikonN/A20x Fluor .5wMicroscopio di dissezione con fluorescenzaLeica MZ Fl IIIN/Acannocchiale di dissezione Leica e lampada fluorescente<tr style='height:21px;'>Pompa peristalticaGilsonN/AMinipuls 2TubingFisher ScientificDipende dallo spessoreTygon R3603, St-GobainSistema di perfusioneWarner64-0135 (VC-66CS)Sistema di controllo della valvola di perfusione, completo, con valvole a manicotto, 6 canaliPerfusion regulatorsLeventon201108Dosi-flow 3Measurement and automation explorerSciences Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380Photon imagerScience Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380Photon viewerScience Wares & National InstumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380ExcelMicrosoftN/Asoftware https://www.microsoft.comVirtual dubopen accessN/Asoftware http://virtualdub.sourceforge.net/