Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Abstract

Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, Viene dimostrata una procedura di ablazione laser a due fotoni, che consente la distruzione selettiva dei neuroni fluorescenti in larve di zebrafish immobilizzate con agarosio. L'imaging ad alta risoluzione prima e dopo la procedura conferma l'efficienza del danno neuronale, come osservato dall'assenza di fluorescenza.

Protocol

1. Ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio laser a due fotoni

1. Inizia impostando l'accoppiamento di una linea Gal4 che etichetta specifici neuroni da studiare e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurati di utilizzare lo sfondo nacre sfondo per entrambi i genitori in modo che nacre omozigoti possono essere ottenuti.
   NOTA: Omozigoti di nacre non contengono melanofori sulla superficie del corpo (Figura 1B). Nel presente studio, vengono utilizzate una linea Gal4 gSAIzGFFM119B (che etichetta il pretectum) e un'altra linea Gal4 hspGFFDMC76A (che etichetta l'ILH (lobo dell'ipotalamo).

2. Il giorno seguente della configurazione dell'accoppiamento, raccogli le uova di zebrafish e portale allo stadio larvale, a quel punto i neuroni di interesse esprimeranno reporter fluorescenti.

3. Monta la larva di pesce zebra in agarosio a basso punto di fusione al 2% (Figura 1B).

1. Inizia preparando una soluzione madre di agarosio al 2%: sciogliere 2 g di polvere di agarosio a basso punto di fusione in 100 mL di acqua del sistema (i.e., l'acqua utilizzata per mantenere il pesce zebra adulto in un sistema di acqua circolante) o acqua E3, portando l'acqua al punto di ebollizione in un microonde, e mescolando energicamente.

   1. Microonde il 2% di agarosio a basso punto di fusione fino a farlo bollire. Versare 3,5-4,0 ml di agarosio sul coperchio di una capsula di Petri da 6 cm. Attendere che l'agarosio si raffreddi in modo che sia caldo al tatto prima di procedere.

   2. Successivamente, posiziona una singola larva (non anestetizzata in questo passaggio) nell'agarosio. Continuare a regolare la posizione e l'orientamento della larva in modo che sia in posizione verticale, utilizzando un ago da dissezione (Figura 1C), fino a quando l'agarosio non si solidifica per garantire il corretto posizionamento della larva.
      NOTA: La larva continuerà a nuotare mentre l'agarosio si solidifica.

   3. Una volta posizionata la larva, attendi 5 minuti affinché l'agarosio si solidifichi completamente.

   4. Versa 5 mL di soluzione di tricaina (0.4% a 1x concentrazione di lavoro) sopra l'agarosio.
      NOTA: Per evitare movimenti delle larve durante l'ablazione laser, le larve devono essere mantenute anestetizzate durante la procedura di ablazione.

4. Ablate la larva utilizzando la funzione di sbiancamento in un sistema di microscopia laser a due fotoni.

1. Posiziona la larva incorporata nell'agarosio sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni e avvia il sistema di microscopia.

2. Avvia il software di acquisizione delle immagini e clicca sul pulsante "On" nella scheda "Laser" per attivare il laser (Figura 1D). Attendere che lo "Stato" del laser passi da "Occupato" a "Modalità bloccata".

3. Nella scheda "Canali", imposta la lunghezza d'onda del laser a 880 nm (potenza massima: circa 2.300 mW) per l'ablazione EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), o a 800 nm (potenza massima: circa 2.600 mW) per l'ablazione GCaMP.

4. Seleziona l'obiettivo 20X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo. Fare clic sulla scheda "Localizza", fare clic su "GFP" (Green Fluorescent Protein) per modificare i percorsi ottici e visualizzare direttamente la fluorescenza a occhio.

5. Individua il cervello larvale del pesce zebra al centro della vista; poi clicca sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia a due fotoni.

6. Come registrazione della condizione 'prima dell'ablazione', scatta un'immagine z-stack con l'obiettivo 20X ad una velocità di scansione elevata (per evitare danni da calore). Successivamente confrontare le immagini scattate prima e dopo gli esperimenti di ablazione (Figura 2A). Per ottenere uno z-stack, fai clic su "Z-Stack" per selezionare l'opzione z-stack ed espandere la scheda. Imposta il limite inferiore (fai clic sul pulsante "Imposta per primo") dopo aver messo a fuoco l'estremità ventrale del cervello larvale e imposta il limite superiore (fai clic sul pulsante "Imposta ultimo") dopo aver messo a fuoco la superficie dorsale più ampia del cervello. Quindi, fai clic sul pulsante "Avvia esperimento" per eseguire l'acquisizione dell'immagine z-stack.

7. Seleziona l'obiettivo 63X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo.

8. Fai clic sulla scheda "Localizza" per passare alla microscopia epi-fluorescente, individua le cellule da ablare al centro della vista dall'occhio, quindi fai clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia a scansione laser.

5. Nella scheda "Modalità di acquisizione", imposta la "Dimensione fotogramma" a 256 x 256. Fai clic su "Live" e osserva i neuroni di interesse.

6. Partendo dal lato più dorsale, trova un piano focale in cui le cellule da ablare sono a fuoco.

7. Contrassegna una piccola area circolare di circa un terzo della dimensione della cellula in diametro su ciascun neurone come regione di interesse (ROI) utilizzando la funzione "Regioni".

8. Imposta la velocità di scansione a 13.93 s/256 x 256 pixel (134.42 μm x 134.42 μm), che corrisponde a un tempo di permanenza laser di circa 200 μs/pixel, o 200 μs/0.5 μm. Inoltre, imposta 4 ripetizioni ("Ciclo di iterazione: 4"). In alternativa, è possibile ottimizzare il numero di iterazioni e la velocità di scansione in modo da ottenere un'ablazione sufficiente.

9. Esegui la funzione 'Sbiancamento' per l'ablazione, in combinazione con la 'Serie temporale (2 cicli)' per visualizzare il campione (prima e dopo l'ablazione) e 'Regioni' (per impostare le ROI) o funzioni equivalenti nel software utilizzato (Figura 1D) .

10. Confrontando la prima immagine (prima dell'ablazione) e la seconda immagine (dopo l'ablazione) nel ciclo delle serie temporali, assicurati che dopo lo sbiancamento, la fluorescenza nelle cellule bersaglio diminuisca a quella osservata a livello di sfondo (Figura 2B).

11. Se la fluorescenza è ancora presente dopo l'ablazione, aumenta il numero di iterazioni.

12. Poi, sposta il piano focale leggermente più in profondità (i.e.<span style='font-family:Roboto; font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>, verso il lato ventrale), e scegli il piano focale successivo dove appaiono le cellule non ablate.

13. Esegui la funzione di sbiancamento. Ripeti questi passaggi fino a quando tutte le cellule della struttura neurale di interesse sono state ablate.

14. Dopo aver esaminato tutti i piani focali che coprono le strutture neurali da ablare, controlla le celle per la fluorescenza abolita. Se alcune cellule risultano ancora fluorescenti a causa di un'ablazione insufficiente, irradiarle nuovamente con il laser come descritto sopra.

15. Se la larva deve essere recuperata dall'agarosio dopo l'irradiazione laser, non cercare di forzarla fuori dall'agarosio perché questo potrebbe danneggiare la larva. Invece, fai con cura piccoli tagli nell'agarosio attorno alla larva perpendicolarmente alla superficie del suo corpo. Quindi, attendi che la larva nuoti da sola fuori dall'agarosio quando l'anestetico svanisce.

16. Procedi alla prossima larva per l'ablazione o esegui esperimenti di controllo utilizzando un'altra popolazione di neuroni che non sono coinvolti nel comportamento in esame.
    NOTA: Qui, come controllo, i neuroni del bulbo olfattivo in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larve sono stati ablati al laser utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra (Figura 2A, a destra).

17. Consenti diverse ore o 1 giorno per il recupero prima di procedere all'imaging Ca o alla registrazione comportamentale. Durante questo periodo di recupero, controlla la salute delle larve (i.e.<span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>, normale nuoto spontaneo, nessun danno da calore apparente intorno all'area ablata, etc.) e rimuovi le larve che mostrano segni di cattiva salute.

Results

Materials