Microscopia a due fotoni per l'imaging in vivo della microvascolarizzazione cerebrale di topo

Abstract

Fonte: Nishimura, C. et al. Quantificazione dell'architettura vascolare cerebrale utilizzando la microscopia a due fotoni in un modello murino di neuroinfiammazione indotta dall'HIV. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra la visualizzazione in vivo dei capillari corticali nel cervello del topo utilizzando la microscopia a due fotoni. Delinea i passaggi per l'iniezione di un colorante fluorescente in un topo anestetizzato con una finestra corticale a cranio sottile, la preparazione della configurazione per l'imaging e l'acquisizione di immagini dettagliate delle strutture microvascolari cerebrali per l'analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione del colorante fluorescente

1. Pizzicare la pelle di un topo anestetizzato sulla coscia sinistra mediale usando la pinza #5. Tirare delicatamente la pelle verso l'alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Preparare il colorante rodamina coniugato con destrano a emissione rossa (70 kDa) (10 mg/kg disciolto in soluzione fisiologica).
2. Individua la vena femorale. Utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 30 G inserito, aspirare una soluzione precedentemente preparata di un colorante fluorescente appropriato per l'imaging sulla linea da 130 μl della siringa. Rimuovere tutte le bolle d'aria aspirando completamente il colorante nella siringa e muovendo con decisione la parete della siringa.
   1. Piega l'ago da 30 G con un angolo di circa 30 gradi premendolo contro una superficie dura con il lato smussato rivolto verso l'alto. Riempire l'ago con il colorante ed eliminare il liquido in eccesso, lasciando un campione di 100 μl.
3. Iniettare lentamente il campione di 100 μl di colorante nella vena femorale. Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione costante e delicata sul sito di iniezione per arrestare l'eventuale sanguinamento. Lasciare circolare il colorante per 5 minuti.
4. Chiudere la coscia sinistra cucendo la pelle con una sutura 4-0, quindi capovolgere con cura il topo sullo stomaco e posizionarlo nell'imbracatura del copricapo del topo.
   

2. In vivo imaging a due fotoni

1. Spostare l'apparecchio chirurgico al microscopio a due fotoni, assicurandosi di mantenere livelli di anestesia continui. Inserire una piccola quantità di soluzione fisiologica allo 0,9% nel serbatoio della piastra di testa e abbassare l'obiettivo del microscopio in modo che entri in contatto con la soluzione salina. Localizzare l'area di interesse utilizzando l'obiettivo di visualizzazione in campo chiaro.
2. Impostare l'eccitazione laser a due fotoni su una lunghezza d'onda appropriata per il colorante fluorescente. Inizia l'imaging a due fotoni utilizzando l'obiettivo 25x.
   Si noti che in questi esperimenti, abbiamo usato un destrano coniugato a un colorante rodamina che emette rosso che è stato eccitato a una lunghezza d'onda di 780 nm. Un filtro di emissione passa-banda 607/36 è stato utilizzato per rilevare la fluorescenza dal colorante e un filtro di emissione passa-banda 480/20 è stato utilizzato per rilevare l'autofluorescenza arteriosa.
3. Individuare un letto capillare sullo schermo di visualizzazione e ingrandire quest'area utilizzando lo zoom ottico 2. Acquisisci immagini dei capillari utilizzando il software di imaging a due fotoni.

Materiali