Imaging a fluorescenza dell'aggregazione della proteina PolyQ nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Abstract

Fonte: Pigazzini, M. L., et. al. Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando l'imaging della durata di fluorescenza. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra l'uso della microscopia a fluorescenza (FLIM) per valutare l'aggregazione della proteina polyQ nei neuroni C. elegans, confrontando vermi di controllo e carenti di proteine chaperone. L'aumento dell'aggregazione nei vermi carenti di chaperone promuove il trasferimento di energia tra fluorofori raggruppati, riducendo la durata della fluorescenza. Le mappe con codice colore generate da FLIM rappresentano queste differenze, evidenziando i livelli di aggregazione tra i gruppi sperimentali.

Protocollo

1. Acquisizione dei dati FLIM

NOTA: In questo protocollo, la durata del fluoroforo viene acquisita tramite il metodo TCSPC nel dominio del tempo. FLIM richiede che il laser generi un impulso di luce a una frequenza di ripetizione impostata e costante. La frequenza di ripetizione varia a seconda del tipo di laser e deve essere conosciuta dall'utente. Le misurazioni della durata sono ottenute da rivelatori e apparecchiature elettroniche installate insieme a un microscopio convenzionale. In questo protocollo, le misurazioni vengono eseguite su tre diversi microscopi confocali a scansione laser con rivelatori e software forniti da due diverse aziende (Table of Materials) per l'acquisizione dei tempi di vita mRFP, CFP e YFP, rispettivamente. Verificare che siano presenti i filtri corretti di emissione/eccitazione e ridurre al minimo lo sfondo o la retroilluminazione del monitor prima di iniziare. Prima di iniziare qualsiasi esperimento, stabilire la fotostabilità del fluoroforo scelto. Se il fluoroforo sbianca in breve tempo all'interno dei tessuti dei nematodi, non è adatto per le misurazioni FLIM in C. elegans.

1. Aprire il software di acquisizione FLIM. Il software FLIM consente anche il controllo del microscopio confocale. Individuare la scheda/pulsante per abilitare le uscite del rilevatore e premere Abilita uscite.
2. Acquisisci la funzione di risposta dello strumento (IRF), che descrive la precisione temporale della configurazione strumentale.
   NOTA: Questo passaggio dovrebbe essere eseguito preferibilmente prima di montare i nematodi.
   1. Se disponibili, rimuovere i filtri di eccitazione/emissione.
   2. Posiziona un vetrino coprioggetti vuoto sopra l'obiettivo e trova la sua superficie. Registrare il segnale di dispersione ottenuto dal vetrino coprioggetti per un minimo di 30 s.
      NOTA: Per durate di diversi nanosecondi, il software di acquisizione può stimare automaticamente lo spostamento IRF. L'acquisizione di un IRF è sempre consigliata.
3. Posiziona la diapositiva con il C. elegans montato sul palco. Utilizzando una lente di ingrandimento 10x in modalità di trasmissione e localizzare la posizione dei nematodi sul vetrino.
4. Rimuovere il vetrino, passare l'obiettivo a una lente con ingrandimento 63x e applicare il mezzo di immersione richiesto (ad es. olio). Riposizionare il vetrino sul tavolino e localizzare i nematodi.
5. Individua il Pinhole Manager sul software di acquisizione e aprilo al Maximum. Avviare la scansione del campione, selezionare una regione di interesse (ad esempio, testa, parte superiore del corpo) e concentrarsi sul piano di proiezione massimo.
6. Monitora la frequenza degli impulsi laser e gli altri tre valori presenti sull'interfaccia del software: il Constant Fraction Discriminator (CFD), il Time-to-Amplitude (TAC), e il Analogue-to-Digital Converter (ADC).
   NOTA: Il laser dovrebbe avere un gate massimo di 1 x 10⁸} conteggi di singoli fotoni. Questo numero rappresenta il numero massimo di fotoni forniti dal laser. Il CFD fornisce informazioni sulla ricezione dell'impulso di un singolo fotone in riferimento all'impulso laser da parte del rivelatore. Questo valore dovrebbe essere circa 1 x 10⁵. Il TAC discrimina tra il momento in cui un fotone è stato rilevato e l'impulso laser successivo. Infine, l'ADC converte la tensione TAC in un segnale di memoria memorizzabile. CFD, TAC e ADC dovrebbero avere valori simili per garantire che i fotoni emessi dal fluoroforo non vadano persi. La corretta valutazione di questi parametri garantisce che vengano raccolti abbastanza fotoni per creare una mappa accurata della durata di vita.
7. Sull'interfaccia del software FLIM, visualizzare in anteprima il numero di fotoni rilevati: il valore ADC deve essere compreso tra 1 x 10⁴ e 1 x 10⁵. Se necessario, spostare la messa a fuoco su un piano diverso o aumentare la potenza del laser per raccogliere più fotoni.
   NOTA: In generale, il numero di fotoni registrati al secondo non dovrebbe superare l'1% della frequenza di ripetizione del laser.
8. Nella barra dei menu, selezionare la scheda per impostare i parametri di acquisizione. Selezionare sincronizzazione della scansione in per consentire il rilevamento di un singolo fotone.
9. Impostare l'acquisizione su un periodo di tempo fisso o su un numero fisso di fotoni. Ad esempio, è possibile acquisire una curva di decadimento della durata per 2 minuti o fino a quando un singolo pixel raggiunge un numero di fotoni di 2.000 singoli eventi. Premi Start per iniziare l'acquisizione.
   NOTA: Diversi fluorofori richiederanno diversi laser e filtri di eccitazione ed emissione. In base alla luminosità del campione, è possibile regolare anche la potenza del laser, il che non interferirà con la durata. Questi protocolli utilizzano le seguenti impostazioni di eccitazione/emissione: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Un laser pulsato a due fotoni è stato impiegato per misure CFP utilizzando ex800/em440 nm. La quantità di tempo e il numero di fotoni necessari per l'acquisizione di una mappa FLIM dovranno essere stabiliti empiricamente per ogni configurazione e per ogni scopo sperimentale.

2. Analisi dei dati FLIM utilizzando il software FLIMfit

NOTA: Eseguire l'analisi dei dati utilizzando lo strumento software FLIMfit sviluppato presso l'Imperial College di Londra (vedere Figura 1).

1. Aprire il software e importare i file di dati FLIM tramite File | Carica dati FLIM. Caricare tutti i campioni da una condizione, anche se ottenuti in sessioni diverse e da ripetizioni biologiche diverse.
2. Se necessario, segmentare un singolo nematode da qualsiasi immagine FLIM tramite Segmentazione | Gestore della segmentazione. Trascina lo strumento di ritaglio intorno all'area di interesse finché non viene evidenziata. Una volta completato, premi OK.
   NOTA: La segmentazione deve essere fatta per tutte le immagini.
3. Selezionare una piccola regione in cui appare l'immagine basata sull'intensità di un C. elegans (Figura 1, Frecce 1). La curva di decadimento di quella regione apparirà nella grande finestra di decadimento sul lato destro dell'interfaccia (Figura 1, Freccia 2).
   NOTA: Il decadimento può essere visualizzato linearmente o logaritmicamente.
4. Impostare i parametri corretti per estrapolare la durata di vita tramite l'algoritmo del software come descritto nei passaggi 2.5-2.8.
5. Nella scheda Dati (Figura 1, Freccia 3):
   1. Imposta un valore arbitrario Minimo integrato per escludere tutti i pixel troppo deboli per produrre un buona vestibilità. A seconda del C. elegans campione questo valore varia da 40 a 300. Inserire valori diversi fino a ottenere un'anteprima soddisfacente.
   2. Selezionare un numero Tempo minimo e un Tempo massimo per limitare il segnale FLIM a questi valori. Verranno esclusi tutti gli eventi che compaiono prima e dopo questa soglia.
      NOTA: Ad esempio, per l'analisi di mRFP, sono stati esclusi gli eventi precedenti a 800 ps e successivi a 4.000 ps. Questi valori dipendono dalla durata del fluoroforo e devono essere determinati dall'utente finale.
   3. Non modificare il preset Counts/Photon di 1.
   4. Inserire il Frequenza di ripetizione, in MHz, del laser utilizzato durante l'acquisizione.
      NOTA: Per il protocollo attuale, sono stati utilizzati laser diversi con vari tassi di ripetizione. Il laser a due fotoni utilizzato per l'acquisizione dei tempi di vita dei CFP possiede una frequenza di ripetizione di 80 MHz, per YFP il laser si ripete a 40 MHz e per mRFP il valore è di 78,01 MHz. Questi valori sono stati inseriti in FLIMfit in base al campione analizzato.
   5. Immettere un valore Gate Max per escludere tutti i pixel saturi.
      NOTA: Per le misurazioni della durata in C. elegans, questo valore è impostato su qualsiasi numero grande (ad esempio, 1 x 10⁸}).
6. Nella scheda Lifetime, selezionare un raccordo globale da utilizzare (ad esempio, un raccordo pixel-wise). Vedere Figura 1, freccia 4.
   NOTA: Un adattamento per quanto riguarda i pixel produrrà un decadimento adattato a ogni singolo pixel. Un adattamento Dal punto di vista dell'immagine produrrà un adattamento globale di ogni singola immagine e mostrerà un singolo valore di vita per immagine. Un fitting a livello globale produrrà un singolo fitting nell'intero dataset. Viene fornito un unico valore di durata per tutte le immagini.
7. Non modificare nessun altro parametro ad eccezione del No. Exp se è noto che il decadimento della fluorescenza scelto è multiesponenziale e mostra più di un singolo tempo di vita.
   NOTA: Nel presente protocollo, questa funzione è stata utilizzata per calcolare i tempi di vita del fluoroforo CFP biesponenziale.
8. Carica l'IRF tramite il menu IRF: IRF | Carica IRF. Per stimare lo spostamento IRF, selezionare IRF | Stima dello spostamento IRF. Un insieme di valori apparirà automaticamente nella scheda IRF. Una volta stabilito ciò, non modificare altri parametri di questa scheda.
9. Una volta impostati tutti i parametri, premere {Adatta set di dati (Figura 1, Freccia 5). L'algoritmo produrrà un adattamento per la curva di decadimento e stabilirà un valore di durata per ogni immagine.
   NOTA: L'adattamento risultante, evidenziato in una linea blu, dovrebbe sovrapporsi a tutti gli eventi. Un buon adattamento si ottiene quando tutti gli eventi sono allineati lungo l'adattamento.
10. Fai clic sulla scheda Parametri (Figura 1, Freccia 6), situata nei menu in alto a destra dell'interfaccia del software, e seleziona Statistica: w_mean (media ponderata) e controlla che il chi2{{ TAG_598}} è il più vicino possibile a 1.
    NOTA: Un chi2 vicino a uno garantisce l'accuratezza dell'adattamento. Il lifetime value dell'immagine selezionata viene quindi rivelato come tau_1.
11. Esporta qualsiasi informazione di interesse: File | Esporta Immagini Intensità/Adatta Tabella Risultati/Immagini/Istogrammi. Salva le impostazioni dei dati utilizzate per calcolare la durata: File | Impostazioni dei dati di salvataggio.
    NOTA: I parametri utilizzati verranno salvati per future analisi dei campioni selezionati.

3. Rappresentazioni grafiche dei dati FLIM

NOTA: Le durate raccolte da diversi campioni possono essere rappresentate visivamente in vari modi. Selezionare questa opzione per indicare i valori di durata in nanosecondi o picosecondi.

1. Mostra la qualità dell'adattamento e l'accuratezza della curva esportando la curva di decadimento direttamente da FLIMfit.
2. Rappresenta la distribuzione dei fotoni tracciando la frequenza del conteggio dei fotoni rispetto al valore del tempo di vita in un istogramma.
3. Infine, per il confronto statistico, se si confrontano due o più campioni, inserire i valori di durata più la deviazione standard della media in un grafico a barre con grafico a dispersione. Esegui qualsiasi analisi statistica desiderata.

Risultati

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