Ecografia non invasiva ad alta frequenza e imaging Doppler dell'emodinamica del cervello di ratto

Abstract

Fonte: Giustetto, P., et. al., Ecografia parenchimale non invasiva, vascolare e metabolica ad alta frequenza e imaging cerebrale profondo fotoacustico del ratto. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo l'uso degli ultrasuoni ad alta frequenza e dell'imaging fotoacustico per studiare la vascolarizzazione e il contenuto di emoglobina nel cervello di ratto. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate sulla perfusione cerebrale e sull'ossigenazione del sangue, consentendo un'analisi non invasiva delle strutture vascolari cerebrali e della distribuzione dell'ossigeno.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione

Anesthesia
1. Posizionare l'animale all'interno dell'apposita camera di isoflurano per anestetizzarlo.
2. Riempire la camera con una miscela di O₂ e gas isoflurano per uso veterinario ad una concentrazione del 2,5% in una camera a gas da 2 L e attendere circa 3 minuti affinché il ratto si addormenti. Controllare l'effetto dell'anestesia con un pizzico di punta.
3. Una volta che l'anestesia ha effetto, rimuovere il topo e pesarlo.
4. Stendere un sottile strato di gel oftalmico idrosolubile sugli occhi dell'animale per proteggerli e mantenere la fisiologica idratazione oculare.
5. Sdraia il topo su un piano di lavoro della stazione di imaging a ultrasuoni e fotoacustica. Per mantenere l'effetto anestesia, posizionare rapidamente il naso all'interno dell'apposita maschera fornendo un flusso di anestesia costante (isoflurano 2%-2,5% in ossigeno 1 L/min).
Rasatura dell'animale
1. Stendere uno strato consistente di crema depilatoria sulla superficie della testa, prestando attenzione alle aree di copertura che circondano le orecchie e il collo. Lasciare agire la crema per alcuni minuti ed estrarla delicatamente con una spatola. Rimuovere delicatamente tutti i resti di crema con una spugna bagnata per pulire accuratamente la pelle.
  NOTA: La pelliccia dell'animale intrappola l'aria che influisce negativamente sull'acquisizione delle immagini basata sugli ultrasuoni, quindi deve necessariamente essere rimossa il più possibile.
Posizionamento dell'animale
1. Disponi l'animale in una posizione a aquila aperta. Monitorare i parametri vitali tramite appositi sensori dei parametri vitali sul piano di lavoro (se presenti). Appoggiare le zampe sui sensori dopo aver applicato alcune gocce di crema per elettrodi per uso professionale.
  NOTA: Durante l'anestesia, assicurarsi che i parametri vitali abbiano i seguenti valori: la temperatura corporea del ratto ≈ 37,5 °C, i battiti cardiaci al minuto (BPM) variano tra 250 e 350 e la frequenza respiratoria è compresa nell'intervallo di 40-80 respiri al minuto.
2. Infine fissare gli arti con un cerotto di seta artificiale ipoallergenico. Se necessario, stendere nuovamente un sottile strato di gel oftalmico idrosolubile per proteggere gli occhi dell'animale.

2. Acquisizione dell'immagine dal punto di vista temporale

Posizionamento dell'animale
1. Mantenendo l'animale in posizione prona, ruotare leggermente il suo corpo di lato, con un angolo di inclinazione di circa 45° rispetto all'asse del corpo sagittale. Utilizzare piccoli rotoli di garza di cotone come supporti per organizzare correttamente lo smaltimento (Figura 1a).
2. Solleva la testa dell'animale e ruotala leggermente su un lato (Figura 1a). Utilizzare un rotolo di cotone come supporto mantenendo il muso ben inserito nella maschera per anestesia.
3. Inclinare il piano di lavoro con un angolo di circa 30° rispetto al piano orizzontale.
4. Ruotare il trasduttore di imaging di un angolo di circa 30° rispetto al piano verticale.
Acquisizione di immagini anaatomiche e vascolari ultrasoniche e fotoacustiche
1. Attivare la scansione di imaging, accedere all'acquisizione dell'immagine in modalità B e impostare correttamente tutti i parametri di acquisizione dell'immagine per rispettare i possibili requisiti dell'esperimento (Figura 2a).
  NOTA: Impostare la frequenza del centro di trasmissione al più basso possibile (16 MHz, Figura 2b), in modo da avere la massima profondità di penetrazione possibile per il trasduttore.
2. Smaltire uno strato consistente (circa 1 cm di spessore) di gel idrosolubile ipoallergenico per la trasmissione degli ultrasuoni sulla testa dell'animale (Figura 1b). Coprire la testa del trasduttore con un sottile strato dello stesso gel e metterla a contatto con lo strato sul ratto. Utilizzare gel caldo per ridurre al minimo l'ipotermia localizzata.
3. Avvia l'acquisizione dell'immagine in modalità B e regola il posizionamento del trasduttore in tempo reale, identificando i riferimenti anatomici e centrando la regione di interesse sul punto medio del monitor. Assicurati di eliminare le bolle d'aria a qualsiasi livello intrappolate nello strato di gel, perché influiscono negativamente sull'acquisizione.
4. Posizionare il trasduttore in modo da allinearlo all'asse virtuale che collega l'orecchio all'occhio (Figura 3a) per ottenere una focalizzazione ottimale del fascio. Acquisire diverse viste del volume interno del cervello, mediante rotazione in senso orario o antiorario (Figura 3b e c).
5. Eventualmente fissare il trasduttore su un supporto meccanico per fissare stabilmente la posizione e regolare l'orientamento in modo preciso.
6. Assicurarsi che la regione cerebrale di interesse si localizzi a 10 mm di profondità rispetto alla sorgente del trasduttore US-LASER per ricevere un segnale di risposta fotoacustica ottimale (Figura 4). Quindi, posizionare l'indicatore della focalizzazione dell'onda US esattamente al centro dell'area analizzata.
  NOTA: Durante la ricerca delle aree di interesse, evitare l'attivazione dell'opzione del cancello di respirazione, al fine di accelerare la procedura di posizionamento.
7. Entra in modalità Color Doppler per visualizzare i vasi sanguigni interni del cervello in modo altamente sensibile.
8. Una volta che il posizionamento è stato impostato in modo appropriato per visualizzare le regioni desiderate, attivare l'opzione del cancello di respirazione per evitare effetti indesiderati legati al movimento (Figura 5a).
9. Scegliere il parametro di acquisizione desiderato impostato in modalità Color Doppler (Figura 5b) e acquisire immagini in questa modalità per distinguere le velocità e le direzioni del flusso sanguigno, fino a diversi millimetri di profondità di penetrazione.

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Risultati

Figura 1: Smaltimento degli animali per l'acquisizione di immagini temporali. a) La disposizione dell'animale sul piano di lavoro per l'acquisizione dell'immagine: dopo la rasatura della testa, l'animale viene posto in posizione prona con il corpo ...