Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Abstract

Fonte: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca²⁺ Dinamica nei terminali assonici dei fotorecettori dei coni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per monitorare la dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni di una retina di topo transgenico. Descrive i passaggi per la preparazione delle fette di retina, l'imaging di biosensori di calcio basati su FRET e l'analisi delle variazioni di fluorescenza per quantificare i livelli di calcio in condizioni di illuminazione di fondo e stimolazione luminosa.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione della fetta (10 - 15 min)
   1. Prepara in anticipo le membrane del filtro in nitrocellulosa per l'affettatura retinica e i vetrini coprioggetti per montare le fette e trasferirle nella camera di registrazione. Tagliare la membrana del filtro in nitrocellulosa in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm utilizzando le forbici. Tagliare i vetrini coprioggetti in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm utilizzando un tagliavetro.
   2. Immergere lentamente un vetrino nella soluzione extracellulare vicino al tessuto. Tirare delicatamente, la fetta di retina ottenuta dal topo biosensore HR2.1:TN-XL Ca²⁺ sul vetrino con il lato della cellula gangliare rivolto verso l'alto, afferrandolo dal bordo con un paio di pinze. Questo processo riduce i danni meccanici e il ripiegamento dei tessuti.
   3. Scegli la regione della retina correlata alla rispettiva domanda di ricerca. Tagliare un pezzo rettangolare di circa 1 x 2 mm dalla regione retinica selezionata utilizzando una lama di bisturi ricurva. Rimuovere la soluzione in eccesso intorno al fazzoletto.
   4. Posizionare la membrana del filtro sopra il pezzo di retina in modo che il lato della cellula gangliare aderisca alla membrana. Immediatamente, aggiungere una goccia di terreno extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto alla membrana.
   5. Trasferire il tessuto retinico montato su membrana nella camera di affettamento contenente una soluzione extracellulare fresca.
   6. Tagliare la retina in fette verticali di 200 μm di spessore (Figura 1B) utilizzando una lama di rasoio fresca attaccata a un tritatessuti. Cambiare la lama per ogni pezzo di retina.
      Nota: la lama del rasoio deve essere perfettamente allineata con la superficie del fondo della camera di affettatura in modo tale che l'intera membrana si divida simultaneamente, come indicato da un suono di "clic" durante il taglio. In caso contrario, la lama potrebbe piegarsi e danneggiare la fetta.
   7. Incollare una singola fetta montata su membrana a un vetrino coprioggetti applicando grasso ad alto vuoto solo sulle estremità della membrana (Figura 1C). Mantenere la superficie del vetro sotto la retina libera da grasso.
   8. Conservare le fette montate sul vetrino coprioggetto coperte da una goccia di soluzione extracellulare nella camera di contenimento - un contenitore chiuso e a prova di luce, ad esempio una capsula di Petri con il coperchio coperto con un foglio di alluminio - in un'atmosfera di carbossigeno a temperatura ambiente (RT). Introdurre carbossigeno facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d'acqua per mantenere umidificata l'atmosfera nella camera di mantenimento; In questo modo si evita che le fette si secchino.
   9. Lasciare riposare le fette nella camera di contenimento per 10 - 15 minuti prima di spostarle (una per una) nella camera di registrazione. Le fette possono essere mantenute fino a 4-5 ore in una camera di mantenimento a RT (~21 °C).

2. Imaging a due fotoni Ca²⁺ Microscopia

a

1. due fotoni
   1. Utilizzare un microscopio a due fotoni di tipo MOM (Movable Objective Microscope).
      Nota: È possibile utilizzare qualsiasi microscopio verticale a due fotoni che soddisfi i seguenti requisiti minimi: Deve essere dotato di (a) un laser pulsato sintonizzabile a ~860 nm, (b) un minimo di due canali di fluorescenza acquisiti simultaneamente, (c) per la proteina fluorescente ciano potenziata (eCFP) e la fluorescenza citrina, (d) uno stimolatore di luce e (e) un software che consente la registrazione di sequenze di immagini time-lapsed a una frequenza di fotogrammi sufficiente a risolvere i segnali di interesse del Ca²⁺.
   2. Avviare il sistema di imaging a due fotoni come indicato dal produttore. Seguire rigorosamente le linee guida sulla sicurezza laser della struttura. Avvia il laser e sintonizzalo su ~860 nm.
   3. Trasferire una fetta dalla camera di mantenimento alla camera di registrazione e iniziare immediatamente a perfondere con soluzione extracellulare carbossigenata. Mantenere una portata di perfusione di 2 ml/min e una temperatura di 37 °C nella camera di registrazione.
   4. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua 20X 0,95 con apertura numerica (NA). Se disponibile, utilizzare una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) in combinazione con un diodo a emissione di luce (LED) a infrarossi sotto la camera di registrazione per localizzare la fetta di retina (Figura 2). In caso contrario, localizzare la fetta utilizzando l'imaging a due fotoni (vedere 2.1.5).
   5. Passa all'imaging a due fotoni per visualizzare l'espressione del biosensore. Attivare i due canali di rilevamento per l'imaging a fluorescenza di eCFP e citrino.
   6. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini che controlla il microscopio a due fotoni per eseguire la scansione e selezionare una fila di terminali a cono per la registrazione (Figura 3A). Impostare l'acquisizione delle immagini su immagini da 128 x 16 pixel (31,25 Hz) o una configurazione simile. Limitare l'area scansionata ai terminali dei coni per evitare lo sbiancamento dei fotopigmenti nei segmenti esterni.
      Nota: per il sensore di calcio TN-XL (τ = ~0,6 sec per il legame Ca²⁺, τ = ~0,2 sec per il Ca²⁺ che si slega), si consiglia un frame rate minimo di ~8 Hz.
   7. Stimolazione e registrazione della luce
      1. Usa uno stimolatore di luce a campo intero per eseguire i seguenti passaggi.
         Nota: Una soluzione semplice per uno stimolatore di luce a campo intero consiste nell'utilizzare due LED filtrati passa-banda (ad esempio, "blu": 360 passa-banda (BP) 12, "verde": 578 BP 10) che corrispondono alla sensibilità della lunghezza d'onda dei coni di topo ma allo stesso tempo non si sovrappongono ai filtri utilizzati per il rilevamento della fluorescenza. La luce dei LED viene focalizzata dal condensatore attraverso il fondo della camera di registrazione (Figura 2).
      2. Accendere il laser e lasciare che i coni si adattino al laser a scansione e alla luce di fondo dello stimolo (20 - 30 sec) prima di presentare gli stimoli luminosi (vedere 2.2.3) o applicare agenti farmacologici.
      3. Iniziare la presentazione di stimoli arbitrari (ad esempio, lampi di luce, come mostrato nella Figura 3B, C). Nel caso dello stimolatore descritto al punto 2.2.1, generare gli stimoli modulando l'intensità dei due LED nel tempo utilizzando una scheda a microprocessore controllata da un software personalizzato.
      4. Iniziare a registrare i due canali di fluorescenza (ad esempio, a 483 nm per il "blu"
   8. Trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET)-donatore eCFP e a 535 nm per l'accettore FRET "giallo") utilizzando simultaneamente il rispettivo software di acquisizione immagini (vedi anche 2.1.6). Ad esempio, nel caso di lampi di luce (Figura 3B, C), registrare almeno 8 - 10 presentazioni di stimolo (prove).

Risultati

Figura 1. Preparazione di fette retiniche verticali. (A) Retina isolata e appiattita preparata per l'affettatura. (B) Pezzo rettangolare di retina (vedi riquadro rosso in A) montato su membrana di carta da filtro (grigio scuro...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Grasso per alto vuoto	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Vetrini coprioggetti	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Vetrini	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Lame per tritatutto	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Tritatutto	Membrana
filtrante in nitrocellulosa a griglia	Merck Millipore	AABG01300	Tipo di filtro: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
Stimolatore a campo intero basato su LED UV/verde	Scheda
	Arduino		http://www.arduino.cc
Software di imaging CfNT	Scritto		Sviluppato da Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germania
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Sistema focale Sistema di perfusione	ALA Scientific Instrument		Con collettore a punta da 100 μm di diametro; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Microscopio a obiettivo mobile (MOM), progettato da W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germania	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w obiettivo	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/

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