Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione della fetta (10 - 15 min)
   1. Prepara in anticipo le membrane del filtro in nitrocellulosa per l'affettatura retinica e i vetrini coprioggetti per montare le fette e trasferirle nella camera di registrazione. Tagliare la membrana del filtro in nitrocellulosa in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm utilizzando le forbici. Tagliare i vetrini coprioggetti in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm utilizzando un tagliavetro.
   2. Immergere lentamente un vetrino nella soluzione extracellulare vicino al tessuto. Tirare delicatamente, la fetta di retina ottenuta dal topo biosensore HR2.1:TN-XL Ca²⁺ sul vetrino con il lato della cellula gangliare rivolto verso l'alto, afferrandolo dal bordo con un paio di pinze. Questo processo riduce i danni meccanici e il ripiegamento dei tessuti.
   3. Scegli la regione della retina correlata alla rispettiva domanda di ricerca. Tagliare un pezzo rettangolare di circa 1 x 2 mm dalla regione retinica selezionata utilizzando una lama di bisturi ricurva. Rimuovere la soluzione in eccesso intorno al fazzoletto.
   4. Posizionare la membrana del filtro sopra il pezzo di retina in modo che il lato della cellula gangliare aderisca alla membrana. Immediatamente, aggiungere una goccia di terreno extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto alla membrana.
   5. Trasferire il tessuto retinico montato su membrana nella camera di affettamento contenente una soluzione extracellulare fresca.
   6. Tagliare la retina in fette verticali di 200 μm di spessore (Figura 1B) utilizzando una lama di rasoio fresca attaccata a un tritatessuti. Cambiare la lama per ogni pezzo di retina.
      Nota: la lama del rasoio deve essere perfettamente allineata con la superficie del fondo della camera di affettatura in modo tale che l'intera membrana si divida simultaneamente, come indicato da un suono di "clic" durante il taglio. In caso contrario, la lama potrebbe piegarsi e danneggiare la fetta.
   7. Incollare una singola fetta montata su membrana a un vetrino coprioggetti applicando grasso ad alto vuoto solo sulle estremità della membrana (Figura 1C). Mantenere la superficie del vetro sotto la retina libera da grasso.
   8. Conservare le fette montate sul vetrino coprioggetto coperte da una goccia di soluzione extracellulare nella camera di contenimento - un contenitore chiuso e a prova di luce, ad esempio una capsula di Petri con il coperchio coperto con un foglio di alluminio - in un'atmosfera di carbossigeno a temperatura ambiente (RT). Introdurre carbossigeno facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d'acqua per mantenere umidificata l'atmosfera nella camera di mantenimento; In questo modo si evita che le fette si secchino.
   9. Lasciare riposare le fette nella camera di contenimento per 10 - 15 minuti prima di spostarle (una per una) nella camera di registrazione. Le fette possono essere mantenute fino a 4-5 ore in una camera di mantenimento a RT (~21 °C).

2. Imaging a due fotoni Ca²⁺ Microscopia

1. due fotoni
   1. Utilizzare un microscopio a due fotoni di tipo MOM (Movable Objective Microscope).
      Nota: È possibile utilizzare qualsiasi microscopio verticale a due fotoni che soddisfi i seguenti requisiti minimi: Deve essere dotato di (a) un laser pulsato sintonizzabile a ~860 nm, (b) un minimo di due canali di fluorescenza acquisiti simultaneamente, (c) per la proteina fluorescente ciano potenziata (eCFP) e la fluorescenza citrina, (d) uno stimolatore di luce e (e) un software che consente la registrazione di sequenze di immagini time-lapsed a una frequenza di fotogrammi sufficiente a risolvere i segnali di interesse del Ca²⁺.
   2. Avviare il sistema di imaging a due fotoni come indicato dal produttore. Seguire rigorosamente le linee guida sulla sicurezza laser della struttura. Avvia il laser e sintonizzalo su ~860 nm.
   3. Trasferire una fetta dalla camera di mantenimento alla camera di registrazione e iniziare immediatamente a perfondere con soluzione extracellulare carbossigenata. Mantenere una portata di perfusione di 2 ml/min e una temperatura di 37 °C nella camera di registrazione.
   4. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua 20X 0,95 con apertura numerica (NA). Se disponibile, utilizzare una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) in combinazione con un diodo a emissione di luce (LED) a infrarossi sotto la camera di registrazione per localizzare la fetta di retina (Figura 2). In caso contrario, localizzare la fetta utilizzando l'imaging a due fotoni (vedere 2.1.5).
   5. Passa all'imaging a due fotoni per visualizzare l'espressione del biosensore. Attivare i due canali di rilevamento per l'imaging a fluorescenza di eCFP e citrino.
   6. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini che controlla il microscopio a due fotoni per eseguire la scansione e selezionare una fila di terminali a cono per la registrazione (Figura 3A). Impostare l'acquisizione delle immagini su immagini da 128 x 16 pixel (31,25 Hz) o una configurazione simile. Limitare l'area scansionata ai terminali dei coni per evitare lo sbiancamento dei fotopigmenti nei segmenti esterni.
      Nota: per il sensore di calcio TN-XL (τ = ~0,6 sec per il legame Ca²⁺, τ = ~0,2 sec per il Ca²⁺ che si slega), si consiglia un frame rate minimo di ~8 Hz.
   7. Stimolazione e registrazione della luce
      1. Usa uno stimolatore di luce a campo intero per eseguire i seguenti passaggi.
         Nota: Una soluzione semplice per uno stimolatore di luce a campo intero consiste nell'utilizzare due LED filtrati passa-banda (ad esempio, "blu": 360 passa-banda (BP) 12, "verde": 578 BP 10) che corrispondono alla sensibilità della lunghezza d'onda dei coni di topo ma allo stesso tempo non si sovrappongono ai filtri utilizzati per il rilevamento della fluorescenza. La luce dei LED viene focalizzata dal condensatore attraverso il fondo della camera di registrazione (Figura 2).
      2. Accendere il laser e lasciare che i coni si adattino al laser a scansione e alla luce di fondo dello stimolo (20 - 30 sec) prima di presentare gli stimoli luminosi (vedere 2.2.3) o applicare agenti farmacologici.
      3. Iniziare la presentazione di stimoli arbitrari (ad esempio, lampi di luce, come mostrato nella Figura 3B, C). Nel caso dello stimolatore descritto al punto 2.2.1, generare gli stimoli modulando l'intensità dei due LED nel tempo utilizzando una scheda a microprocessore controllata da un software personalizzato.
      4. Iniziare a registrare i due canali di fluorescenza (ad esempio, a 483 nm per il "blu"
   8. Trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET)-donatore eCFP e a 535 nm per l'accettore FRET "giallo") utilizzando simultaneamente il rispettivo software di acquisizione immagini (vedi anche 2.1.6). Ad esempio, nel caso di lampi di luce (Figura 3B, C), registrare almeno 8 - 10 presentazioni di stimolo (prove).

Figura 1. Preparazione di fette retiniche verticali. (A) Retina isolata e appiattita preparata per l'affettatura. (B) Pezzo rettangolare di retina (vedi riquadro rosso in A) montato su membrana di carta da filtro (grigio scuro) dopo l'affettatura. (e) Vista dall'alto della fetta di retina montata su membrana fissata su un vetrino coprioggetti utilizzando grasso. (D) Disegno schematico di una parte di una fetta di retina (vedi riquadro rosso in C). I fotorecettori a cono sono indicati in verde. V, ventrale; D, dorsale; N, nasale; T, temporale; OS, segmento esterno; ONL, strato nucleare esterno; OPL, strato plessiforme esterno; INL, strato nucleare interno; IPL, strato plessiforme interno; GCL, strato di cellule ganglionari.

Figura 2. Imaging a due fotoni di fette di retina: Illustrazione della configurazione di registrazione. In alto: Lente dell'obiettivo a immersione in acqua che focalizza il raggio del laser a scansione (freccia rossa verso il basso) nella retina e raccoglie la fluorescenza emessa (frecce verso l'alto). L'obiettivo raccoglie anche la luce infrarossa trasmessa da un LED di illuminazione montato sotto il condensatore durante l'imaging della fetta utilizzando una telecamera CCD. Centro: Fetta di retina montata nella camera di registrazione e perfusa con soluzione extracellulare. In basso: Lente a condensatore che focalizza la luce proveniente dai LED di stimolazione (e dal LED a infrarossi per l'imaging della telecamera CCD) attraverso il fondo trasparente della camera di registrazione nel tessuto retinico. LED IR, diodo a emissione di luce a infrarossi; CCD, dispositivo ad accoppiamento di carica; BP, passa-banda.

Figura 3. Risposte Ca2+ evocate dalla luce nei terminali assonici dei fotorecettori dei coni di topo. (A) A sinistra: Registrazioni focalizzate sui terminali sinaptici (riquadro rosso) dei fotorecettori a cono (verde) in fette di retina. A destra: Esempio per una regione registrata con 7 terminali individuali. La fluorescenza è stata registrata utilizzando due canali: uno per il citrino accettore FRET (in alto; 535 BP 50) e uno per l'eCFP donatore di FRET (in basso; 480 BP 32). (B) Cambiamenti evocati dalla luce nella fluorescenza citrinica (FA) e eCFP (FD) registrati in un singolo ROI. (e) Ca2+ risposte (come rapporto FA/FD) di un terminale conico a una serie di lampi di luce intensa di 1 secondo a intervalli di 5 secondi. ROI, regione di interesse; BP, filtro passa-banda; F, intensità della fluorescenza; u.a., unità arbitrarie; FRET, trasferimento di energia per risonanza di Förster; eCFP, proteina a fluorescenza ciano potenziata. Intensità dello stimolo (come tasso di foto-isomerizzazione in 103·P·s-1 per cono): 13,0 e 12,8 per le opsine M e S, rispettivamente, sommandosi a un livello di fondo (= LED spenti, scansione laser di eccitazione) di ~10.