Imaging di cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller durante la rigenerazione retinica del pesce zebra

Abstract

Fonte: Lahne, M., et.al. Coltura di espianti retinici di zebrafish transgenico adulto per l'imaging di cellule vive mediante microscopia multifotonica. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'imaging su cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller in espianti retinici di pesce zebra inclusi in agarosio a seguito di danni ai fotorecettori indotti dalla luce. Il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) rilasciato dai fotorecettori danneggiati attiva le cellule gliali di Muller, innescando la migrazione nucleare attraverso gli strati nucleari interni ed esterni per la mitosi e la generazione di progenitori neuronali. Le immagini catturate rivelano le dinamiche della migrazione nucleare e della differenziazione dei progenitori durante la rigenerazione retinica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.

1. Microscopia multifotone

NOTA: Gli esperimenti eseguiti in questo manoscritto sono stati ottimizzati per un microscopio multifotone dotato di un laser a infrarossi (vedi Tabella dei materiali), un obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza 40X Apo (N.A. 1.15), uno scanner galvanometrico e una camera ambientale che contiene un inserto per quattro piastre di Petri da 35 mm. Le immagini sono state acquisite con un rivelatore non scansionato (R-NDD).

1. Prima dell'imaging, equilibrare la camera ambientale per ottenere un'atmosfera del 5% di CO₂/aria. Assicurarsi che le piastre di Petri vuote siano inserite nel supporto per evitare perdite di gas nella stanza.
2. Accendere il sistema di microscopia.
3. Una volta che la camera climatica è stata bilanciata, aggiungere il liquido con indice di rifrazione sull'obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza 40X Apo (N.A. 1.15).
   NOTA: Il liquido con indice di rifrazione con proprietà ottiche simili all'acqua viene utilizzato per evitare l'evaporazione dell'acqua durante l'imaging a lungo termine.
4. Posizionare i fluoropiatti con espianti retinici nella camera. Utilizzando la luce in campo chiaro, posizionare il campione nel percorso della luce e portare la regione centrale della retina dorsale nel piano di messa a fuoco.
5. Utilizzare la luce epifluorescente GFP per mettere a fuoco i nuclei gliali di Müller positivi per gfap:nGFP (Figura 1A, C).
   NOTA: Se gli espianti non sono montati in piano o l'agarosio si accumula sotto l'espianto, sarà difficile mettere a fuoco i nuclei positivi per gfap:nGFP o emetteranno una fluorescenza debolmente.
   1. Controlla se il passaggio a una regione diversa all'interno dello stesso espianto di retina supererà il problema della messa a fuoco. In caso contrario, passare a un altro espiantante di retina.
6. Nel software di acquisizione immagini, aprire le finestre 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Compact GUI' e 'Acquisizione ND'. Per l'imaging multifotone, assicurarsi che l'opzione 'IR NDD' sia scelta nell''interfaccia grafica compatta A1
.
7. Nel campo 'impostazioni', selezionare IR-DM per il 1° specchio dicroico e scegliere il filtro passa banda 525/50 per acquisire la fluorescenza GFP.
8. Accendi il laser IR nella finestra etichettata "A1MP GUI". Ci vorranno alcuni minuti prima che il laser sia pronto. Impostare la lunghezza d'onda su 910 nm per eccitare la fluorescenza GFP e allineare il laser facendo clic sul pulsante "Allineamento automatico" nella finestra "A1 MP GUI".
9. Assicurarsi che le luci della stanza e dell'apparecchiatura siano spente o coperte prima di aprire l'otturatore nell'"GUI A1 MP" per evitare la sovraesposizione del tubo fotomoltiplicatore. Per ridurre i livelli di rumore, collocare il microscopio in un ambiente buio.
10. Acquisizione di immagini con un campo visivo di 300 x 300 pixel, con uno zoom di due e un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 μs/pixel. Impostare approssimativamente la potenza del laser modificando l'"area di acquisizione" nell'"GUI A1MP" e il guadagno nella finestra "GUI A1 Compact".
11. Impostazione dello z-stack
    1. Concentrati sullo strato di celle gangliari (GCL) per impostare il piano focale superiore dello z-stack nella sottofinestra 'z' all'interno della finestra 'Acquisizione ND'. Alcune cellule gfap:nGFP-positive si trovano tipicamente nello strato di cellule ganglionari, il che aiuta a identificare il limite basale della retina (Figura 1A, D).
    2. Spostare il piano focale attraverso il livello dello strato nucleare esterno (ONL) (Figura 1A, B), che è caratterizzato dalla presenza di celle gfap:nGFP positive debolmente etichettate che sono rotonde e ingrandite rispetto alle loro controparti nello strato nucleare interno (INL) (Figura 1A, C).
    3. Impostate questo piano come parte inferiore dello z-stack. Assicurarsi che l'intero ONL venga ripreso (Figura 1A, B).
    4. Quando si verificano spostamenti del piano focale che richiedono una nuova regolazione durante il periodo di imaging, fare doppio clic sulla posizione centrale nella sottofinestra 'z' per assegnarla come posizione 'home'. Passa a "modalità simmetrica definita" e fai clic su "relativo".
    5. Impostare la dimensione del passo z tra 0,7 e 1 μm.
12. Correzione dell'intensità Z:
    1. Applica correzioni dell'intensità z per compensare la perdita di intensità dei pixel dovuta alla dispersione della luce durante l'imaging negli strati profondi del tessuto.
    2. Per impostare la correzione, aprire la finestra "correzione intensità z". Per impostare l'intervallo 'z-stack', scegliere 'Da ND'.
    3. Fare clic sul piano focale inferiore nella finestra "correzione dell'intensità z" (in questo caso, corrisponde allo strato di cellule ganglionari) e impostare l'intensità del laser ("area di acquisizione" nell'"interfaccia grafica A1MP") e il guadagno (GUI A1 Compact).
    4. Fare clic sulla freccia accanto ai "valori z" nella finestra "correzione intensità z" per confermare le impostazioni che vengono successivamente visualizzate in "impostazioni dispositivo" nella finestra "correzione intensità z" per il piano focale scelto.
    5. Ripetere il processo per i piani centrale e superiore, aumentando la potenza e il guadagno del laser. Se necessario, è possibile aggiungere ulteriori piani focali. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni specifiche del laser e del guadagno per gli esperimenti nelle Figure 1 - 3.
    6. Impostare l'area di acquisizione nella finestra "A1 MP GUI". Evitare di selezionare un'area di acquisizione superiore a 15 e un guadagno superiore a 126 all'inizio dell'imaging per eludere il fotobleaching e l'aumento dei livelli di rumore.
       NOTA: Poiché i laser e i tubi fotomoltiplicatori differiscono tra i sistemi di microscopia, testare le impostazioni del laser e del guadagno per ottenere condizioni di imaging ottimali per la configurazione del microscopio, evitando il photobleaching.
    7. Scegli "Correzione intensità relativa" nella finestra "Correzione intensità z".
13. Nella sottofinestra 'serie temporali' nella finestra 'Acquisizione ND', impostare la durata su 8 ore e l'intervallo su 'nessun ritardo'. Quindi, assicurati di fare clic su "Esegui correzione z" nella finestra secondaria "z-stack" nel pulsante della finestra "Acquisizione ND" per acquisire le serie temporali 3D.
14. Mantenere gli espianti retinici a una temperatura di 27 - 29 °C per tutta la durata dell'acquisizione dell'immagine.
15. Durante il periodo di acquisizione dell'immagine, se necessario, regolare nuovamente il livello di potenza e il guadagno per mantenere la qualità dell'immagine per l'analisi post-imaging. Per le regolazioni, eseguire i passaggi 1.11.2 - 1.11.4.
16. Se il piano focale si sposta, mettere in pausa o interrompere la corsa ed eseguire nuovamente il passaggio 1.11.
    NOTA: Se è stata scelta la "correzione z relativa" nel passaggio 1.12.7 ed è stato eseguito il passaggio 1.11.4, non dovrebbe essere necessario regolare nuovamente i livelli di potenza e guadagno, a meno che non si sia verificato un intenso fotobleaching.

Tabella 1: Laser e livelli di guadagno utilizzati per le correzioni dell'intensità z sui diversi piani per gli esperimenti visualizzati nelle Figure 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Potenza laser	Guadagno	Potenza laser	Guadagno
Superiore (fotorecettore a bastoncello)	13	126	3,5	118
Medio (glia di Muller)	10	126	2,8	118
Inferiore (strato di cellule ganglionari)	8	126	2,1	118

Risultati

Figura 1: Ricostruzione 3D di Z-stack multifotoni retinici. A) Ricostruzione 3D di una serie di immagini z-stack multifotone di cellule gfap:nGFP-positive in colture retiniche a montaggio intero di zebrafish dopo 48 ore di danno lumi...

Materiali