Imaging del danno cerebrale indotto da ipossia-ischemia cerebrale in un modello murino

Abstract

Fonte: Ouyang, Y., et al. Imaging simultaneo PET/MRI durante l'ipossia-ischemia cerebrale del topo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra una tecnica per valutare il danno da ipossia cerebrale tramite tomografia a emissione di positroni (PET) e risonanza magnetica (MRI) simultanee. Un topo anestetizzato viene sottoposto a legatura dell'arteria carotide comune (CCA), riducendo il flusso sanguigno a un emisfero cerebrale e predisponendolo a lesioni indotte dall'ipossia. La PET e la risonanza magnetica valutano il metabolismo del glucosio e i cambiamenti strutturali durante l'ipossia. La risonanza magnetica rileva una limitata diffusione dell'acqua, mentre la PET rivela una ridotta captazione del glucosio, indicando stress cellulare indotto dall'ipossia e compromissione metabolica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Legatura unilaterale dell'arteria carotide comune (CCA)

1. Preparare il campo sterile con strumenti chirurgici sterilizzati e materiali posizionati comodamente. Assicurarsi che il termoforo sia riscaldato a 37 °C con la sonda di temperatura posizionata saldamente sul pad. Assicurati di utilizzare un telo sterile per coprire il sito chirurgico.
2. Anestetizzare l'animale (isoflurano, 1-3% nell'aria a 0,5-1 L/min) e posizionare l'animale in posizione supina con la coda rivolta verso l'esterno. Controllare l'anestesia pizzicando l'alluce: questo non dovrebbe suscitare alcuna reazione se l'animale è adeguatamente anestetizzato. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
3. Applicare la crema depilatoria sulla parte inferiore del collo fino alla parte superiore del torace utilizzando 1-2 tamponi di cotone. Attendere 1-3 minuti, quindi rimuovere i peli e la crema utilizzando una garza bagnata o tamponi imbevuti di alcol. Tamponare l'area dell'incisione con Betadine in modo circolare dall'interno verso l'esterno, quindi indossare guanti chirurgici sterili.
4. Con le forbici chirurgiche, praticare un'incisione di circa 1 cm lungo la linea mediana della parte inferiore del collo. Separare accuratamente la pelle esterna dalla fascia circostante utilizzando le forbici chirurgiche.
5. Utilizzando due pinze per sutura dell'iride micro McPherson, separare l'arteria carotide comune destra dalla fascia, facendo attenzione a non danneggiare le vene o disturbare il nervo vago.
6. Utilizzando la pinza a destra, esteriorizzare il CCA destro in una posizione stabile. Applicare diverse gocce di soluzione fisiologica per evitare che si secchi. Passare una lunghezza adeguata (2-3 cm) di sutura di seta 6-0 sotto il CCA destro e legare con un doppio nodo quadrato. Facoltativamente, legare nuovamente utilizzando una seconda lunghezza di sutura di seta 6-0.
7. Riposizionare il CCA destro e pulire il liquido in eccesso dall'apertura utilizzando un tampone sterile con punta in spugna. Chiudere l'incisione con sutura di seta 6-0. Applicare la lidocaina per via topica fino a 7 mg/kg.
8. Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia fino all'ambulatorio (circa 30 minuti) ed eseguire il monitoraggio post-chirurgico fino a quando l'animale non è pronto per l'imaging.

2. Preparazione per l'imaging: controlli del sistema e dell'hardware

1. Configurare l'hardware e il software per i sistemi MRI e PET e verificarne la funzionalità come segue. Assicurati che tutte le connessioni fisiche siano sicure e che le impostazioni del software siano selezionate in modo appropriato.
   1. Assicurati che il sistema PET sia alla temperatura di esercizio prescritta di 5 °C utilizzando il sistema di raffreddamento ad aria.
   2. Montare il sistema PET all'interno del foro della risonanza magnetica, allineando i centri del campo visivo (FOV) della PET e della risonanza magnetica utilizzando offset assiali noti. Montare la bobina MRI all'interno del foro del sistema PET e centrare la bobina con il sistema PET e i centri del magnete MRI.
   3. Attiva l'elettronica PET per l'alimentazione e la tensione di polarizzazione (Nota: i passaggi variano in base allo strumento). Eseguire una scansione rapida (5 minuti) utilizzando un cilindro 68Ge e controllare il sinogramma risultante per assicurarsi che tutti i rilevatori siano operativi.
   4. Opzionalmente acquisire i dati da utilizzare per una matrice di trasformazione PET/MRI a scopo di co-registrazione: riempire un fantoccio tridimensionale (ad esempio, tre sfere riempite) con 200 μCi di soluzione acquosa 18F e acquisire per 15 minuti con PET. Acquisizione dei dati anatomici della risonanza magnetica: nella finestra di controllo della scansione, selezionare la sequenza multi-slice multi-echo (MSME) (vedere la Tabella 1). Ripetere per tutti e tre gli orientamenti principali: assiale, sagittale e coronale.
2. Controllare le impostazioni e il funzionamento della pompa di infusione. Impostare la pompa a 4,44 μl al minuto, che in 45 minuti di infusione costante eroga un volume totale di 200 μl, il limite tipico raccomandato per l'iniezione endovenosa (e.v.) in un animale di 20 g.
3. Controllare il funzionamento del riscaldatore e verificare che la temperatura erogata sia sufficiente a mantenere l'animale al caldo (37 °C). Verificare che il monitoraggio della temperatura e delle vie respiratorie sia operativo in preparazione al posizionamento dell'animale sulla cuccia dell'animale.
4. Verificare il funzionamento dei flussimetri O2 e N2 (per 0,5 L/min: O2 a 57,2 mg/min e N2 a 0,575 g/min) accendendoli entrambi con la fonte di aria compressa spenta e le fonti di O2 e N2 accese. Per evitare il rischio di danneggiare i flussimetri, non accenderli senza una pressione di ingresso sufficiente.
5. Assicurarsi che il vaporizzatore di isoflurano sia sufficientemente pieno. Prima dell'imaging, avviare il flusso di anestesia con isoflurano all'1-2% e da 0,5 a 1 L/min.
6. Prepara la cuccia degli animali assicurandoti che l'anestesia, il cuscinetto respiratorio e i sistemi di riscaldamento siano posizionati in modo sicuro e funzionale. Per una maggiore precisione di co-registrazione PET/MRI, i marcatori fiduciali (ad esempio, tubi capillari riempiti con radiotracciante a una concentrazione simile a quella iniettata per l'imaging) possono essere attaccati al letto dell'animale all'interno del campo visivo.

3. Flusso di lavoro dell'imaging

Dopo aver completato tutti i controlli necessari dell'apparecchiatura, procedere all'imaging come segue:

1. Anestetizzare l'animale con isoflurano e inserire il catetere della vena caudale (ago da 28 G, tubo in PE-10 inferiore a 5 cm) riempito con soluzione fisiologica eparinizzata (0,5 ml di eparina, 1.000 USP/ml, in 10 ml di soluzione fisiologica). Il riscaldamento dell'animale e/o della coda può migliorare la precisione dell'inserimento del catetere. Opzionalmente, posizionare una goccia di adesivo cianoacrilato sul sito di inserimento per fissare la linea IV.
2. Trasferisci l'animale nella cuccia preparata. Assicurarsi che la testa dell'animale sia sicura, con gli incisivi superiori fissati dalla barra dentale e le barre auricolari in posizione, se utilizzati.
3. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza. Inserire il termometro a sonda rettale. Assicurarsi che le letture della temperatura e della respirazione siano funzionanti.
4. Aspirare la dose di radiotracciante (circa 600 μCi in 200 μl) da iniettare in un tubo PE-10 eparinizzato di lunghezza appropriata - circa 3 m per il tubo PE-10 e un volume di 200 μl. Collegare un'estremità di questo tubo alla siringa della pompa per infusione e l'altra alla linea del catetere della vena caudale, facendo attenzione a non creare forature nel tubo.
5. Far scorrere la cuccia in avanti nel foro del magnete, assicurandosi di non disturbare il posizionamento della bobina di risonanza magnetica e di eventuali linee o cavi, in particolare il tubo dell'anestesia. Assicurarsi che il centro del cervello sia allineato con i centri della bobina MRI, del sistema PET e del magnete MRI.
6. Eseguire la sintonizzazione e l'abbinamento della bobina MRI ruotando le manopole di regolazione sulla bobina, riducendo al minimo le discrepanze di impedenza (controllare le specifiche della bobina) e frequenza (300 MHz per 1H a 7 Tesla) osservando il display del preamplificatore ad alta potenza.
7. (MRI) Dopo la messa a punto e l'abbinamento, acquisire un'immagine di ricognizione: selezionare una sequenza di imaging rapido con echi rifocalizzati (RARE) ed eseguire la sequenza dalla finestra di controllo della scansione. Controllare il posizionamento dell'animale, ripetendo i passaggi 3.5 e 3.6 se necessario. Reimpostare gli spessori al valore zero.
8. (MRI) Acquisire una scansione spettroscopica localizzata e risolta in punti (PRESS) in un volume all'interno del cervello: eseguire una sequenza PRESS (vedere la Tabella 1) in un volume rettangolare con dimensioni 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Controllare la larghezza della linea di galleggiamento utilizzando il comando macro CalcLineWidth. Se il valore di larghezza completa a metà massimo (FWHM) è accettabile (ad esempio, 0,2 ppm), continuare con il passaggio 3.10. In caso contrario, procedere al passaggio 3.9.
9. (MRI) Acquisire una mappa dei campi: eseguire una sequenza FieldMap (vedere la Tabella 1). Utilizzare i dati risultanti per uno spessore di proiezione multi-angolo (MAPSHIM) eseguendo il comando macro MAPSHIM e selezionando le regolazioni locali lineari e del secondo ordine (z2). Ripetere il passaggio 3.8.
10. (MRI) Posizionare il piano di fetta per la scansione di imaging pesata in diffusione (DWI) (vedi Tabella 1): utilizzando l'editor di geometria, assicurarsi che il FOV di acquisizione sia posizionato in modo da acquisire il volume di interesse desiderato all'interno del cervello. Se il piano di sezione risultante è allineato come desiderato, copiarlo nella finestra di controllo della scansione per tutte le scansioni DWI successive. Inizia l'acquisizione.
11. (PET) Con l'acquisizione del PET preparata e pronta per iniziare, avviare la pompa di infusione. Dopo il ritardo predeterminato in cui è stata iniettata la soluzione fisiologica dal catetere, iniziare l'acquisizione della PET (vedere Tabella 1) per catturare l'ingresso del radiotracciante. Monitorare il tasso di conteggio e cercare un aumento graduale del conteggio indicativo di un'iniezione riuscita.
12. Dopo 10-15 minuti, iniziare la sfida ipossica in concomitanza con il passaggio 3.12. Per avviare la sfida ipossica, disattivare il flusso d'aria medicale e accendere immediatamente i flussimetri di O2 e N2 con le impostazioni predeterminate per erogare l'8% di ossigeno e il 92% di azoto e ridurre l'isoflurano allo 0,8%. Non accendere i flussimetri senza pressione di ingresso.
13. (MRI) Contemporaneamente al passaggio 3.12, iniziare l'acquisizione DWI preparata nel passaggio 3.10 (scansione "H1").
14. (MRI) Iniziare l'acquisizione DWI (scansione "H2"), preparata al punto 3.10, subito dopo il completamento della scansione H1. Porre fine alla sfida dell'ipossia spegnendo i flussimetri, ripristinando il flusso d'aria medicale e riportando la concentrazione di isoflurano a un valore adeguato in base al monitoraggio fisiologico.
15. (MRI) Acquisire una scansione DWI post-ipossia preparata al passaggio 3.10. Spegnere la pompa di infusione al termine di questa scansione.
16. (MRI) Acquisire immagini anatomiche nei piani assiale e sagittale. Nella finestra di controllo della scansione, selezionare la sequenza MSME (vedere la Tabella 1). Utilizzando l'editor di geometria, assicurarsi che il campo visivo di acquisizione copra il cervello.
17. Rimuovere l'animale, riportarlo nella gabbia quando è deambulante e monitorare i segni di morbilità, sopprimere se necessario con somministrazione di CO2 seguita da lussazione cervicale come metodo secondario.

Tabella 1. Parametri della sequenza di impulsi MRI per le scansioni descritte nel protocollo e parametri di acquisizione, istogramma e ricostruzione PET.

Imaging Acquisizione Parametri e Acquisizione Hardware
Diffusione MRI (EPI-DWI)
Tempo di acquisizione	15 min
Dimensione matrice	256 x 64
Fette	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Dimensioni voxel	0,117 x 0,219 x 0,8 mm
Larghezza di banda spettrale effettiva	150 kHz
TE	41 msec
TR	3.000 msec
Media di	6
segmenti k-space	16
valori b	0, 400, 800 sec/mm2
Risonanza magnetica anatomica (MSME)
Tempo di acquisizione	5 min
Dimensione della matrice	: 256 x 256
Fette	16
FOV	30 x 22 x 12,8 mm
Dimensione del voxel	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 msec
TR	1.000 msec
medie 1
ripetizione,	1
scansione spettroscopica risolta in punti (PRESS)
Tempo di acquisizione	15 s
Dimensioni voxel	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 msec
TR	2.500 msec
Medie	6
FieldMap
Tempo di acquisizione	1 min 21 sec
1st TE	1,49 msec
2nd TE	5,49 msec
TR	20 msec
Medie 1
Acquisizione PET, istogramma, e Parametri di Ricostruzione
Tracer	[18F]FDG
Velocità di infusione	4,44 μL/min
Tempo di acquisizione	60 min
Dimensione dell'immagine per fetta	128 x 128
Fette	99
Dimensione del voxel	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Inquadratura dinamica	12 x 300 sec
Tipo di ricostruzione	OS-MLEM (6 sottoinsiemi, 6 iterazioni)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forbici chirurgiche
	Roboz	RS-5852 Pinza Roboz RS-5237
Pinza per zanzare Hartman	Miltex	7-26
2x pinza per sutura McPherson, 8,5 cm	Strumenti chirurgici e scientifici accurati	4473	È utile ridurre la larghezza di apertura con una fascia sulle pinze utilizzate per trattenere l'arteria carotide
6-0 sutura di seta intrecciata rivestita di silicone con ago 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
Sistema di coperte omeotermiche	Harvard Apparatus	507220F
Super colla	(Generico)
Misuratore di portata per ipossia
per O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
Flometro per N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
O₂metro	MSA	Altair Pro
Imaging
7.05 Tesla MRI System	Bruker	BioSpec	diametro interno del foro 20 cm con set di gradiente. Software Paravision 5.1.
Volume Tx/Rx 1H bobina, 35mm ID	Bruker	T8100
PET sistema	(interno)		4x24 LSO-PSAPD rivelatori,
10x10 LSO array per rivelatore,
1,2mm passo cristallino e 14mm profondità. 14 x 14 mm PSAPD. Campo visivo: 60x35mm. Finestra di energia 350-650 keV. Finestra di temporizzazione di 16 ns.
Incannulamento dei vasi Pinze Dumont	Roboz	RS-4991
Tubo in polietilene PE-10	BD Intramedic	427401
Pompa per infusione	Braintree Scientific	BS-300
Attrezzature per il monitoraggio e il gating degli animali	Small Animal Instruments Inc.	Modello 1025	Solo monitoraggio della respirazione utilizzato
Cuccia per animali con regolazione della temperatura	(In-house)