Imaging time-lapse di cellule primarie della corteccia cerebrale di topo trasfettate

Abstract

Fonte: Landeira, B. S.,et al., Imaging dal vivo di cellule primarie della corteccia cerebrale utilizzando un sistema di coltura 2D. J. Vis. Exp. (2017)

Il video dimostra l'uso dell'imaging time-lapse per tracciare i progenitori corticali marcati in fluorescenza, monitorare la loro divisione e differenziazione e studiare lo sviluppo del lignaggio nelle cellule primarie della corteccia cerebrale

Protocollo

1. Video-microscopia time-lapse

NOTA: Questo passaggio richiede un microscopio a fluorescenza invertito con una camera di incubazione (vedi Tabella dei materiali).

1. Dopo l'infezione da retrovirus, posizionare la piastra di coltura tissutale in un incubatore collegato ai controller di temperatura e CO₂.
   NOTA: Il preriscaldamento della camera per 3 ore prima di iniziare l'imaging potrebbe aiutare a minimizzare la deriva e la sfocatura durante l'acquisizione.
   NOTA: La camera dovrebbe mantenere le celle a condizioni costanti di 37 °C e 5% di CO₂.
2. Selezionare una posizione sull'asse XY che funga da punto zero (XY = 0). Ciò consentirà a un riferimento di ritrovare le posizioni in futuro.
   NOTA: Si consiglia di disegnare un segno sulla targa che possa essere utilizzato come riferimento per determinare il punto zero.
3. Selezionare le posizioni da riprendere con un ingrandimento 10X.
   NOTA: Selezionare 10-15 posizioni per pozzetto per aumentare la probabilità di osservare cellule trasfettate retrovialmente.
   NOTA: Gli obiettivi ad alto ingrandimento a lunga distanza (20X o 40X) possono essere utilizzati per ottenere immagini ad alta risoluzione. A seconda della distanza di lavoro degli obiettivi, potrebbero essere necessarie piastre con fondo in vetro.
4. Acquisisci immagini a contrasto di fase ogni 5 minuti e immagini a fluorescenza ogni 3 ore per ridurre la fototossicità. Controllare e regolare la messa a fuoco nelle prime 3 ore dell'esperimento, poiché potrebbe cambiare mentre la temperatura si equilibra. Controllare e regolare la messa a fuoco ogni giorno.
   NOTA: Osserviamo che la messa a fuoco diventa stabile dopo le prime 24 ore. Tuttavia, è consigliabile monitorare la messa a fuoco. In alternativa, utilizzare un sistema di messa a fuoco automatica basato su software.
5. Dopo 7 giorni, interrompi l'acquisizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurigo
Microscopio per osservatori cellulari	Zeiss
Il software Tracking Tool (tTt)		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html