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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Colorazione fluorescente di interneuroni viventi
1. Trasferire le fette cerebellari con una pipetta Pasteur tronca in vetro a foro largo in una piastra a 6 pozzetti (max 3 fette/pozzetto). Aspirare il mezzo della soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks.
2. Incubare le fette (3 max) in 5 ml di soluzione di carico del colorante fluorescente (10 μM).
3. Per proteggere dalla luce, coprire la micropiastra con un foglio di alluminio. Posizionarlo su un tavolo giroscopico a 35 giri/min per 10 minuti a RT per facilitare la marcatura delle celle.
4. Trasferire le fette sulla membrana di un inserto Transwell (dimensione dei pori 3,0 μm; Figura 1D) con una pipetta Pasteur tronca in vetro a foro largo. Aspirare il mezzo di carico con la pipetta.
5. Rimuovere l'inserto e riempire il pozzetto con 1,9 ml di Dulbecco's modified eagle medium (DMEM). Riposizionare l'inserto e aggiungere 100 μl di DMEM sulla parte superiore della fetta per coprire il tessuto.
6. Collocare la piastra contenente gli inserti di coltura nella camera dell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 2 ore, sufficienti per osservare le cellule granulari (GC) nello strato molecolare (ML). Stendere i tessuti in piano per consentire l'adesione sulla membrana dell'inserto (Figura 1E). Assicurarsi che le fette non si asciughino.
2. Ex vivo Imaging attraverso macroscopia confocale
1. Trasferire la piastra senza il coperchio di plastica in un'incubatrice fissata al supporto di un macroscopio confocale. Posizionare un coperchio di vetro sull'inserto della piastra del macroscopio. Mantenere la temperatura della camera a 37,0 °C ± 0,5 °C e fornire alle fette un flusso di gas costante (95% O2, 5% CO2) attraverso l'inserto della piastra per mantenere costante il pH. Attendere altre 2 ore prima dell'esperimento time-lapse.
2. Per visualizzare la migrazione dei GC nelle fette di tessuto, illuminare la preparazione con una luce di lunghezza d'onda di 488 nm per mezzo di un diodo laser attraverso un macroscopio a scansione laser confocale dotato di un obiettivo a secco X2 (distanza di lavoro: 39 mm, diametro: 58 mm, NA = 0,234) e rilevare l'emissione di fluorescenza da 500 a 530 nm.
1. Per risolvere con precisione il movimento dei GC, acquisire immagini con un fattore di zoom ottico aggiuntivo da 1,5 a 2,0. Raccogli immagini di GC in un singolo piano focale o fino a 10 diversi piani focali lungo l'asse z ogni 30 minuti per un massimo di 12 ore.
3. Se necessario, rimuovere il coperchio di vetro e aggiungere piccoli volumi (1-10 μl) di attivatori o inibitori biologici in DMEM con una pipetta da 10 μl per studiare il loro effetto sulla migrazione dei GC.
3. Tracciamento delle celle
1. Per ogni volta che si parte il filmato, eseguire la proiezione z-stack tramite la modalità di tipo ecart in ImageJ. Modulare il contrasto e i livelli di luminosità delle immagini successive per facilitare l'identificazione e l'inseguimento dei GC etichettati. Mappare manualmente ogni posizione sull'istantanea di riferimento (a t = 0).
1. Utilizzare il plug-in "Tracciamento manuale" nel menu Analizza particelle e determinare facendo clic sul punto di gravità di ciascun corpo cellulare durante il timelapse. Esporta i dati di tracciamento non elaborati in un foglio di calcolo.
2. Riorganizza i dati di tracciamento grezzi esportati da ImageJ con un programma intelligente fatto in casa che identifica ogni cella e le posizioni associate. Utilizzando il programma, calcola la distanza totale percorsa e la velocità media di migrazione per ogni cella. Classificare e confrontare le caratteristiche della migrazione cellulare in condizioni di controllo e trattamento sotto filtri appropriati utilizzando lo stesso programma.
