Imaging time-lapse della divisione delle cellule staminali neurali di topo mediante microscopia confocale

Abstract

Fonte: Daynac, M., et. al. Smistamento cellulare di cellule staminali neurali e progenitrici dalla zona subventricolare del topo adulto e imaging dal vivo delle loro dinamiche del ciclo cellulare. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'imaging time-lapse di cellule staminali neurali (NSC) da un cervello di topo transgenico utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Le NSC emettono fluorescenza rossa durante la fase G1 e non sono fluorescenti in altre fasi del ciclo cellulare. Una coltura di NSC aderente viene posta nella camera di imaging, vengono impostati i parametri di imaging e le immagini vengono acquisite a intervalli regolari per la durata desiderata.

Protocollo

1. Configurazione di base prima della coltura e della videomicroscopia

1. Utilizzare piastre di coltura con fondo di vetro o μ-piastre per la microscopia video confocale. Per 1 - 5 x 10³ celle/pozzetto, utilizzare piastre a 96 pozzetti e per più di 5 x 10³ celle/pozzetto, utilizzare piastre a 24 pozzetti.
2. Almeno un giorno prima di iniziare l'esperimento, preparare piastre sterili rivestite di poli-D-lisina (PDL) per colture monostrato aderenti. Aggiungere una quantità sufficiente di PDL (10 μg/ml in acqua distillata o dH₂O) per ricoprire il fondo di ciascun pozzetto e incubare per una notte (O/N) a 37 °C. Rimuovere la soluzione di PDL e risciacquare tre volte con dH₂O prima di lasciare asciugare la piastra nella cappa per almeno 2 ore sotto flusso laminare. Se non viene utilizzato immediatamente, conservare la piastra rivestita a -20 °C.
3. Preparare il terreno di coltura mescolando il terreno basale di cellule staminali neurali (NSC) e l'integratore per la proliferazione delle NSC in un rapporto 9:1 ( vedere la tabella dei materiali) insieme a 2 μg/ml di eparina, 20 ng/ml di fattore di crescita epidermico ricombinante umano purificato (EGF), e 10 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani 2 (FGF-2). Riscaldare il terreno di coltura a 37 °C a bagnomaria prima dell'uso.
4. Per la dissociazione della zona subventricolare (SVZ), preparare una soluzione di papaina: 1 mg/ml di papaina (15 UI/ml) in Earl's Balance Salt Solution (EBSS) contenente 0,2 mg/ml di L-cisteina, 0,2 mg/ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,01 mg/ml di DNasi I in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Equilibrare la soluzione a 37 °C prima dell'uso.
5. Per arrestare la reazione enzimatica, preparare una soluzione inibitrice della proteasi (Ovomucoid): terreno eagle modificato di dulbecco (DMEM):F12 contenente 0,7 mg/ml di inibitore della tripsina di tipo II. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm.
6. Preparare la soluzione di glucosio PBS allo 0,6% per raccogliere il cervello e la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) PBS allo 0,15% per le fasi di lavaggio e per la colorazione degli anticorpi.
7. Prepara gli strumenti di dissezione: forbici, pinze per dissezionare e legare e un bisturi. Immergili in etanolo al 70%.

2. Raccolta di cervelli di topo adulto e microdissezioni SVZ

1. Sacrificare topi adulti con indicatore del ciclo cellulare di ubiquitinazione a fluorescenza (FUCCI) (da 2 a 3 mesi e/o 12 mesi per studi sull'invecchiamento), eseguendo una lussazione cervicale in conformità con le linee guida istituzionali appropriate.
2. Spruzza il mouse con etanolo al 70% e taglia la testa usando forbici affilate.
3. Fai un'incisione lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
4. Eseguire un taglio longitudinale della linea mediana partendo dalla base del cranio verso i bulbi olfattivi utilizzando un piccolo paio di forbici. Assicurati di evitare di danneggiare il cervello sottostante con le lame delle forbici. Rimuovere la parte superiore aperta del cranio con una pinza curva per esporre il cervello.
5. Raccogli il cervello in una capsula di Petri da 15 mm contenente lo 0,6% di glucosio in PBS.
6. Sezionare i bulbi olfattivi. Posiziona il cervello sulla sua superficie dorsale e fai una sezione coronale attraverso il chiasma ottico usando un bisturi.
7. Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la parte rostrale della sezione cerebrale con la superficie coronale tagliata rivolta verso l'alto verso lo sperimentatore.
8. Per sezionare la SVZ, rimuovere il setto con una pinza curva fine, quindi inserire una punta di una pinza fine nello striato immediatamente adiacente al ventricolo e staccare la SVZ dal tessuto circostante. Mettere la SVZ sezionata in una capsula di Petri contenente 1 ml di PBS-0,6% di glucosio.

3. Dissociazione tissutale SVZ

1. Tritare la SVZ sezionata nella capsula di Petri fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni.
2. Trasferire il tessuto tritato insieme al glucosio PBS-0,6% in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 min.
3. Scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di papaina preriscaldata (1 mg/ml, preparata al punto 1.4) integrata con 0,01 mg/ml di DNasi I. Incubare per 10 min a bagnomaria a 37 °C. Utilizzare 1 ml di papaina per topo.
4. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
5. Aggiungere 1 ml di ovomucoide preriscaldato (0,7 mg/ml, preparato al punto 1.5) per arrestare l'attività della papaina. Dissociare meccanicamente il tessuto tritato in una sospensione a singola cellula pipettando delicatamente su e giù 20 volte attraverso un puntale per micropipetta p1000. Evitare le bolle d'aria.
6. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile da 20 μm in una nuova provetta da 15 ml. Assicurarsi di lavare il filtro della cella con PBS 0,15% BSA per evitare di perdere le celle.
7. Centrifugare a 200 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μl di PBS contenente lo 0,15% di BSA.

4. Colorazione immunofluorescente per lo smistamento cellulare

Per lo smistamento cellulare utilizzando topi FUCCI-Red (Figura 1A), utilizzare i seguenti anticorpi: CD24 ficoeritrin-cianina7 coniugato [PC7]; CD15/LeX isotiocianato di fluoresceina [FITC] coniugato e ligando EGF coniugato Ax647.

Nota: Le cellule LeX⁺ EGFR⁺ e le cellule EGFR⁺ non sono abbondanti nella SVZ adulta: ≈ rispettivamente 600 e 1500 cellule/topo. Si consiglia di raggruppare le cellule SVZ da 2 a 3 topi per avere abbastanza materiale. Non lavorare con più di 12 topi nello stesso giorno in modo che la durata dello smistamento delle cellule non superi le 3 ore. Tieni presente che lavorare con troppi topi nello stesso giorno porterà a un aumento della durata dello smistamento cellulare, con conseguente aumento della morte cellulare e/o della differenziazione cellulare.

1. Eseguire la colorazione FACS in 100 μl di PBS 0,15% BSA per topo (o in 200 μl per un gruppo di 2 o 3 topi per una colorazione ottimale).
2. Preparare i tubi di controllo. Utilizzare perline di compensazione per preparare i tubi di controllo del colore singolo secondo il protocollo del produttore. Selezionare una frazione di cellule (1/10 delle cellule estratte da un topo è sufficiente) e separarla in 4 provette per preparare 1 provetta di controllo negativo (cellule non marcate) e 3 provette di controllo a fluorescenza meno uno (FMO). Risospendere le cellule in 200 μl di PBS 0,15% BSA per provetta.
   Suggerimento: Per il controllo LeX-FITC FMO, etichettare le cellule con CD24-PC7 (1:50) e ligando EGF coniugato con Ax647 (1:200); per il controllo FMO CD24-PC7, marcare le cellule con CD15/LeX-FITC (1:50) e ligando EGF coniugato Ax647 (1:200) e per il controllo FMO con ligando EGF coniugato Ax647, marcare le cellule con CD15/LeX-FITC (1:50) e CD24-PC7 (1:50).
3. Per le provette utilizzate per la selezione cellulare, utilizzare i seguenti anticorpi alla diluizione indicata in PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) e ligando EGF coniugato con Ax647 (1:200).
4. Incubare per 20 minuti a 4 °C al buio. Lavare con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 x g per 10 min. Risospendere le cellule in 200 μl di PBS 0,15% BSA per cervello. Tenere le provette di selezione delle cellule sul ghiaccio e procedere immediatamente alla selezione delle cellule.
5. Se si utilizzano topi FUCCI-Green, separare le frazioni LeX-positive e LeX-negative utilizzando colonne di separazione prima dello smistamento cellulare, poiché l'anticorpo LeX-FITC condivide la stessa lunghezza d'onda di emissione della fluorescenza FUCCI-green (Figura 2A, B).
   1. In primo luogo, marcare le cellule con un anticorpo LeX umano di topo (1:50) per 15 minuti a 4 °C al buio in 100 μl di PBS 0,15% BSA.
   2. Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 x g per 10 minuti, quindi etichettare le cellule con microsfere IgM anti-topo (1:10) per 15 minuti a 4 °C al buio.
   3. Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 x g per 10 min. Risospendere le cellule in 500 μl di PBS 0,15% BSA e versare le celle attraverso la colonna di separazione nel campo magnetico come schematizzato in Figura 2C. Lavare la colonna con 1 ml di PBS 0,15% BSA per ottenere la frazione LeX negativa.
   4. Per ottenere una frazione LeX-positiva, rimuovere la colonna di separazione dal campo magnetico ed eluire le cellule con 2 ml di PBS 0,15% BSA.
   5. Procedere alla colorazione del ligando EGF coniugato CD24-PC7 e Ax647 come indicato in 4.2.

5. Ordinamento delle celle

Nota: Le celle sono state ordinate su un selezionatore FACS a 40 Psi con un ugello da 86 μm. La fluorescenza è stata raccolta utilizzando il seguente set di filtri: 520/35 nm (FITC), 575/26 nm (PE), 670/20 nm (Ax647) e 740LP (PC7). La compensazione è necessaria per evitare falsi segnali positivi poiché si riscontra una sovrapposizione tra gli spettri di emissione della fluorescenza rossa FUCCI e il colorante PC7.

1. Immediatamente prima dello smistamento delle cellule, aggiungere un colorante vitale per distinguere le cellule vive da quelle morte. Abbiamo utilizzato Hoechst (HO) (vedi tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 2 μg/ml. Far passare il tubo di controllo negativo (celle non contrassegnate) attraverso lo smistatore FACS e selezionare le celle utilizzando i parametri di dispersione laterale (SSC) e di dispersione diretta (FSC) (Figura 3A).
   NOTA: Le celle morte sono state escluse controllando solo la frazione HO-negativa (Figura 3A), e poi i doppietti sono stati esclusi selezionando la frazione negativa dell'ampiezza dell'impulso (Figura 3A).
2. Eseguire i controlli a colore singolo preparati al punto 4.2 e, se necessario, regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) (ad es. popolazione negativa troppo alta e/o celle positive fuori scala). Eseguire la compensazione del colore nella finestra di compensazione del software.
3. Eseguire i controlli FMO preparati nel passaggio 4.2 (controllo FMO LeX-FITC, controllo FMO CD24-PC7 e controllo FMO ligando EGF coniugato Ax647) e disegnare le porte di ordinamento (Figura 3). Smistare le cellule direttamente in 100 μl di terreno di coltura in microprovette da 1,5 ml.

6. Preparazione delle cellule per la microscopia

1. Piastra le cellule appena selezionate a una densità di 1 - 3 x 10³ cellule/pozzetto su piastra μ a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina con 300 μl di terreno di coltura.
2. Prima della videomicroscopia, incubare le piastre di coltura a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 1 ora per consentire l'adesione cellulare.

7. Impostazione del microscopio e acquisizione delle immagini

1. Esegui l'imaging dal vivo utilizzando un obiettivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) su un sistema di microscopio a scansione laser confocale collegato a una camera termostatica invertita a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5%.
2. Posizionare la μ-Plate a 96 pozzetti all'interno della camera termostatata preriscaldata ed equilibrata e sostituire il coperchio con un coperchio termostatato.
3. Aprire il software NIS-Elements e fare clic nella barra dei menu su "Acquisisci/Controlli di acquisizione/Acquisizione ND" per selezionare le opzioni del time-lapse (lunghezza, posizioni dello stadio, sezioni z confocali,...), "Controlli di acquisizione/acquisizione/Ti Pad" per selezionare gli obiettivi e "Controlli di acquisizione/acquisizione/Impostazioni A1plus" per selezionare il livello PMT per ogni fluorescenza nella barra dei menu. Selezionare una cartella in cui salvare i file di dati.
4. Utilizzando la finestra di acquisizione ND, impostare il centro di ciascun pozzetto come posizione del tavolino e selezionare l'opzione dell'immagine grande su 7 x 7 mm². Questo creerà un'immagine a mosaico attorno al centro di ogni pozzo. Impostate la sovrapposizione per l'immagine del mosaico grande al 5%. Scatta foto ogni 20 minuti per 24 ore. Seleziona l'obiettivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) nella finestra Ti Pad.
5. Nella finestra Impostazioni A1plus, acquisire le immagini utilizzando uno scanner risonante ad alta velocità in formato 512 x 512 pixel con una risoluzione di 1,26 μm/pixel. Usa il campo chiaro per visualizzare le forme delle celle. Nel caso di topi FUCCI-Red, eccitare la fluorescenza rossa a 561 nm e raccogliere utilizzando un filtro a 595/50 nm. Nel caso di topi FUCCI-Green, eccitare la fluorescenza verde a 488 nm e raccogliere utilizzando un filtro da 530/40 nm. Determinare il livello PMT ottimale, l'offset e la potenza del laser per ciascuna lunghezza d'onda.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione di messa a fuoco automatica per il canale di campo chiaro per consentire al software di mettere a fuoco automaticamente in ogni posizione stage prima di ogni acquisizione. Suggerimento: è stato utilizzato un obiettivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) per la sua eccellente risoluzione senza bisogno di olio. Altri obiettivi possono essere utilizzati a seconda della risoluzione ottica desiderata.
6. Selezionare il pulsante 'Esegui ora' nella finestra di acquisizione ND per iniziare l'acquisizione.

Risultati

Figura 1: Analisi dal vivo del ciclo cellulare utilizzando topi FUCCI-Red. (A) Rappresentazione schematica del ciclo cellulare FUCCI-Red, dove le cellule sono rosso-fluorescenti durante il G₁ fase e incolore durante le fasi S-G...

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