Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Summary

In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Abstract

Tessuto cellule staminali residenti mesenchimali (MSC) sono importanti regolatori della riparazione dei tessuti e la rigenerazione, la fibrosi, l'infiammazione, l'angiogenesi e la formazione di tumori. Nel loro insieme questi studi suggeriscono che MSC polmone residente svolgere un ruolo durante l'omeostasi del tessuto polmonare, ferite e la riparazione in corso di malattie come la fibrosi polmonare (PF) e l'ipertensione arteriosa (PAH). Qui descriviamo una tecnologia per definire una popolazione di MSC polmone residenti. La definizione di questa popolazione in vivo del tessuto polmonare con una serie di definire marcatori facilita l'isolamento ripetuto di una popolazione staminali ben caratterizzato cellulare mediante citometria di flusso e lo studio di un tipo specifico di cellule e la funzione.

Protocol

1. Isolamento del polmone

1. Sacrificio topi adulti (8-10 settimane di età, 18-20 g; C57Bl6J) topi con una dose eccessiva di isoflurano seguito da dissanguamento con tecnica sterile. Profili varia leggermente tra i ceppi.
2. Rimuovere chirurgicamente il diaframma, aprire la cavità toracica, tagliando la gabbia toracica laterale su ciascun lato del mouse. Lavare il sangue dai polmoni mediante perfusione del ventricolo destro del cuore delicatamente con 3-5mls di tampone fosfato (PBS).
3. Sezionare i lobi polmonari rimuovendo trachea, i bronchi grandi e metterlo in una capsula di Petri riempite con soluzione salina tampone Hanks (HBSS). Seguente raccolta di tutte le pinze lobi polmonari sono utilizzati per posizionare il tessuto sul coperchio del piatto. Tessuto viene poi macinato in piccoli pezzi con bisturi monouso con abbastanza liquido per mantenerli umidi, ma non così tanto che galleggiare e muoversi.
4. Sezionare uno degli arti posteriori di uno dei topi e isolare il midollo osseo da utilizzare come un controllo colorazione per impostare la flow citometria cancelli. Macchia del midollo osseo (BM), come descritto in precedenza ^1.

2. Preparazione di una sospensione cellulare singola da tessuto polmonare

1. Ogni polmone è digerito utilizzando un peso ottimizzato dei tessuti in rapporto al volume di 0,2 g: 5mls di pre-riscaldato 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; cat # LS004202) disciolto in HBSS sterile. La miscela è immerso in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min ^2,3.
2. Triturare campione bene fino a digerire il tessuto polmonare scorre facilmente attraverso una pipetta da 10 ml (circa 10 ripetizioni). Incubare per altri 15 minuti a 37 ° C per completare il tessuto digerisce e assicura una sospensione più uniforme singola cellula.
3. Diluire la sospensione cellulare del polmone con HBSS e triturare con una pipetta da 5 ml per disperdere frammenti di tessuto residuo.
4. Filtrare la sospensione con un colino 70μM cellula per rimuovere frammenti di tessuto non digerito. Campione può essere diviso in multipltubi e conici, a questo punto per evitare di sovraccaricare uno colino cellula e diminuire il tempo.
5. Pellet la sospensione cellulare per 10 min a 1500 giri e decantare il surnatante.
6. Risospendere il pellet cellulare delicatamente con temperatura ambiente RBC lisi buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere un volume equivalente di HBSS di inattivare il tampone di lisi e filtrare la sospensione cellulare usando un colino 40μM cellula per rimuovere i detriti e aggregati cellulari.
7. Pipettare 10μl di ciascun campione da colorare e contare il numero di cellule sia per il polmone e campioni di BM con un emocitometro. Nota: registrare il volume totale delle cellule.
8. Pellet la sospensione cellulare di cellule polmonari mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min.
9. Risospendere sia polmoni e le cellule BM a 1x10 ⁶ cellule / ml in preriscaldata (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modificato Eagle medio, alto livello di glucosio (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) contenente il 2% Bovi fetalene siero (FBS) e HEPES 10mM.
10. Preparare una soluzione 1mg/ml stock di Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in acqua e filtro sterilizzare ^1,4. Il colorante Hoechst può essere memorizzato come aliquote a -80 ° C.
11. Aggiungi Hoescht 33342 colorante ad una concentrazione finale di 5μg/ml (a 200x diluizione di uno stock 1mg/ml) alla sospensione singola cella.
12. Mescolare delicatamente le cellule inversione e incubare in bagnomaria a 37 ° C per esattamente 90 minuti.

3. Colorazione e Preparazione della sospensione di Polmone di Cellula per l'analisi Citometria a Flusso

1. Dopo 90 minuti tutti i punti con le cellule polmonari Hoechst macchiato deve essere eseguito a 4 ° C o su ghiaccio per evitare efflusso colorante. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min a 4 ° C e risospendere le cellule in ghiaccio freddo colorazione tampone (PBS +2% FBS).
2. Risospendere le cellule ad una concentrazione non superiore a 1x10 ⁷
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Discussion

Noi abbiamo adattato un metodo inizialmente utilizzato per identificare BM cellule ematopoietiche per isolare una specifica popolazione di MSC polmone residenti. A causa della riproducibilità di isolamento queste cellule sono state poi ben caratterizzati come MSC. La loro origine è stato definito come residente nel polmone topo adulto (al contrario di BM derivati) e un profilo fenotipico e molecolare documentata ^2. La capacità di isolare ripetutamente questa popolazione caratterizzata permette lo studio ulteriore della importanza biologica e il ruolo delle MSC polmone durante l'omeostasi dei tessuti e la malattia. La definizione recente di questa popolazione in vivo sia in murine e umane del tessuto polmonare facilita lo sviluppo di una strategia terapeutica rivolta al recupero delle cellule endogene per facilitare la riparazione ai polmoni durante lesioni e la malattia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Tampone fosfato (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks soluzione salina tamponata (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% Worthington collagenasi di tipo 2	Worthington Biochemicals	LS004202
Globuli rossi tampone di lisi	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Hoechst 33342 dye	Sigma	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
Propidio ioduro	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% tripsina / EDTA	Cellgro	25-053-Cl
MesenCult Media completo	Stem Cell Technologies	05511
0,4% w / v colorazione Giemsa soluzione	Sigma	GS1L
4% paraformaldeide	Microscopia Elettronica Servizi	15710	16% paraformeldehyde è diluito al 4% con PBS
Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE)	Sigma	21888